酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
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酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA) 利用抗原抗體之間專(zhuān)一性鍵結(jié)之特性，對(duì)檢體進(jìn)行檢測(cè)；由于結(jié)合于固體承載物(一般為塑膠孔盤(pán))上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設(shè)計(jì)其鍵結(jié)機(jī)制后，配合酵素呈色反應(yīng)，即可顯示特定抗原或抗體是否存在，并可利用呈色之深淺進(jìn)行定量分析。
目錄 |
歷史與展望
二十幾年來(lái)，免疫學(xué)分析方法發(fā)展很快，特別是在使用標(biāo)記了的抗原和抗體的分析技術(shù)以后，使原來(lái)許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后，在70年代初期又建立了用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)。由于酶的高效生物催化作用，一個(gè)酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了放大作用，使得原來(lái)極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái)，這種技術(shù)被稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相繼分別報(bào)道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。
ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：
- 免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。
- 研究抗酶抗體的合成。
- 顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。
- 定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。
基本原理
ELISA的基本原理有三條：
（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；
（2）抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；
（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。
種類(lèi)
由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標(biāo)記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因?yàn)榇朔N放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。常用的ELISA有以下兩個(gè)方面。
測(cè)定抗原
主要有：
1、競(jìng)爭(zhēng)法（Competition method）：本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個(gè)過(guò)程，稱(chēng)為包被（Coated），也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測(cè)定的未知抗原的量。這種方法所測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位即可，因此，對(duì)小分子抗原如激素和藥物之類(lèi)的測(cè)定常用此法。該法的優(yōu)點(diǎn)是快，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)保溫洗滌過(guò)程。但需用較多量的酶標(biāo)記抗原為其缺點(diǎn)。
2、雙抗體夾心法：本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類(lèi)的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定。HbSAg及HbS的測(cè)定。
測(cè)定抗體
所用的方法稱(chēng)為間接法，也是目前最常用的方法。間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測(cè)抗體之標(biāo)本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標(biāo)記抗抗體，(對(duì)人的標(biāo)本來(lái)說(shuō)即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM)，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測(cè)抗體的量，其結(jié)果可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定，本法用不同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標(biāo)記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲(chóng)病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標(biāo)記抗人IgM,則可用于早期診斷。
應(yīng)用
ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)大，原則上ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。
酶免疫試驗(yàn)（EIA）結(jié)合光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡可進(jìn)行抗原定位與結(jié)構(gòu)的研究，用酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合免疫擴(kuò)散及免疫電泳可提高試驗(yàn)的敏感性。在實(shí)際應(yīng)用方面可作疾病的臨床診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定等。因此，它和生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、流行病學(xué)及傳染病學(xué)等方面密切相關(guān)。
檢查抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當(dāng)，在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）等，在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），對(duì)前者的敏感性已達(dá)到與放射免疫試驗(yàn)相當(dāng)?shù)乃剑珜?duì)CEA檢查的敏感性較低，目前尚不能用于常規(guī)診斷,在傳染病的診斷方面正在日益擴(kuò)大，其中最滿意的是用于檢查乙型肝炎表面抗原。國(guó)內(nèi)外已有ELISA檢測(cè)的商品供應(yīng)。
尚有用于檢查霍亂弧菌、大腸肝菌、綠膿桿菌和破傷風(fēng)梭菌毒素；腦膜炎球菌及淋球菌抗原；檢查免疫抑制病人中常見(jiàn)的白色念殊菌抗原，檢查病人或病獸的糞便中的輪狀病毒，自病人標(biāo)本中檢查甲肝病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨細(xì)胞病毒等。還可用于植物組織漿液中檢查植物病毒。此外尚試用于測(cè)鉤體抗原及血吸蟲(chóng)病的循環(huán)抗原等。在免疫化學(xué)方面可用于檢測(cè)白蛋白，免疫球蛋白的各種組份，也可用于檢測(cè)補(bǔ)體成份，如：ciq，還能用于檢測(cè)蛇毒。
檢查抗體方面：用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對(duì)多種傳染病和寄生蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷，亦開(kāi)始廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。在寄生蟲(chóng)病方面，它用于對(duì)瘧原蟲(chóng)、阿米巴、利日曼原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、囊蟲(chóng)、弓漿蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)、血絲蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)病等血清學(xué)診斷，這對(duì)人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。在病原微生物方面已用于檢查鏈球菌、沙門(mén)氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還可用于破傷風(fēng)抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測(cè)定以及檢測(cè)斑疹傷寒立克次氏體感染后的抗體，可作診斷。對(duì)立克次氏體還可用以鑒別密切有關(guān)的種屬。也有用于檢查鸚鵡熱衣原體抗體的報(bào)導(dǎo)。試用于病毒抗體檢查報(bào)告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹、風(fēng)疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其敏感性都超過(guò)目前常用的檢查方法。此外，還可用于鑒定病毒型別，例如皰疹病毒。如能進(jìn)一步改進(jìn)方法用于檢查特異性IgM，可以作為早期診斷以及了解體內(nèi)有關(guān)抗原的清除情況。在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測(cè)定以及對(duì)過(guò)敏的診斷，例如檢測(cè)各種過(guò)敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等。在衛(wèi)生學(xué)方面，可用于檢測(cè)食品中葡萄球菌腸毒素及沙門(mén)氏菌毒素等等。
局限性
從以上的簡(jiǎn)單介紹中可以看出，ELISA法由于本身所具備的優(yōu)越性，是一項(xiàng)很有發(fā)展前途的血清學(xué)診斷方法，而且應(yīng)用的領(lǐng)域也越來(lái)越廣泛。但是我們認(rèn)為ELISA不是萬(wàn)應(yīng)良方，用它來(lái)代替一切，這是不當(dāng)?shù)摹Ｒ驗(yàn)镋LISA法還有局限性：
- 由于ELISA所用的抗原大部分還是混合的可溶性抗原，所以對(duì)同一微生物寄生蟲(chóng)或其他物質(zhì)不同部位的抗原還沒(méi)有分開(kāi)。
- 內(nèi)源性過(guò)氧化酶的普遍存在，如人腦組織中，呼吸道分泌物的炎癥細(xì)胞中及某些病毒的組織培養(yǎng)中均有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活力，常不易除去，如果用某些方法除去時(shí)，則病毒的抗原性亦受到破壞，對(duì)于用ELISA檢測(cè)不利。
- 對(duì)ELISA法的非特異性評(píng)價(jià)的資料尚不夠完善，因此，對(duì)出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)的時(shí)候，往往不易解釋。
- 固相載體的質(zhì)量常不統(tǒng)一，主要是原料及制備工藝還不一致，致使不同批號(hào)的固相載體有時(shí)本底值較高，有時(shí)吸附性能很差，影響試驗(yàn)結(jié)果。
- 試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙過(guò)海，各顯神通”，標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。
參看
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酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及其應(yīng)用.鮑行豪
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