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臨床生物化學(xué)

診斷分子生物學(xué)基本技術(shù) 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 基因工程的常用工具 目的基因 基因庫(kù)的建立 核酸的分離與純化 探針制備

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建立基因庫(kù)的目的是為了便于目的基因的保存、擴(kuò)增和純化。基因庫(kù)是利用工具酶，通過(guò)基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)化、篩選而建立，也是基因克隆的過(guò)程。實(shí)際上是利用低等生物如細(xì)菌、病毒、噬菌體等生長(zhǎng)快，繁殖力強(qiáng)的特點(diǎn)，而作為一種核酸擴(kuò)增篩選的載體，把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重組于其中，經(jīng)篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因，成為便于保存，取用方便的基因庫(kù)?；驇?kù)交流是研究室之間交流目的基因的常用方式。

（一）基因重組

基因重組方案很多，簡(jiǎn)單的可用同一種限制性內(nèi)切酶分別在載體和目的基因切出相對(duì)應(yīng)的切口，便于連接。也可用末端連接酶合成連接器（圖18-3）。近年，Okayama方案為實(shí)驗(yàn)室普遍采用，該方法可得到全長(zhǎng)的cDNA。

（二）轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化目的是把有復(fù)制能力，但在細(xì)胞外無(wú)復(fù)制活性的目的基因-載體重組體裝入細(xì)胞（大腸埃希菌），使目的基因隨載體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟介紹如下：

圖18-3　基因重組方案之一

⒈大腸埃希菌的處理（增加細(xì)胞膜通透性，便于基因進(jìn)入細(xì)胞）大腸埃希菌（E.Coli cells）接種于Lb agar培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)一晚。挑選3~5個(gè)大菌落，接種于50ml LB培養(yǎng)基，37℃，振搖培養(yǎng)一晚后，在A₅₅₀測(cè)定，要求細(xì)菌繁殖一定量（一般為細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），野生型（rec＋，5x10⁷cells/ml）為0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x10⁷cells/ml）為0.5-0.6。離心棄去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl₂懸浮菌體。冰浴20分鐘，低溫離心。棄上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl₂懸浮。4℃可保存48小時(shí)，用于轉(zhuǎn)化，稱competent cells。

⒉質(zhì)粒（如經(jīng)基因重組建立的重組質(zhì)粒，基因庫(kù)等）的轉(zhuǎn)化 將competent cells（以美國(guó)BRL公司DH10B菌株為例）置冰水浴。同時(shí)將Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)定）塑料試管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059試管中，加10倍稀釋的巰基乙醇1μl，冰浴輕搖2分鐘，放置10分鐘。取0.1-50ng質(zhì)粒加入試管，輕輕搖勻，冰浴30分鐘。此間備好42℃水浴。并將SOC培養(yǎng)基置42℃?zhèn)溆?。將試管置?2℃，輕搖45秒鐘，馬上置冰浴2分鐘。使competent cells熱脹冷縮，把質(zhì)粒導(dǎo)入菌體。加42℃SOC培養(yǎng)基0.9ml于試管，37℃培養(yǎng)1小時(shí)。1000rpm離心10分鐘，棄上清液，用200μlSOC培養(yǎng)基懸浮菌體。接種于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)一晚。已轉(zhuǎn)化的菌體可形成菌落（因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其產(chǎn)物的基礎(chǔ)上對(duì)菌落進(jìn)行鑒定。并在LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)?；驇?kù)的建立、轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增、純化的過(guò)程就是基因克隆的過(guò)程。

LB培養(yǎng)基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10gNaCl，高壓滅菌，pH7.5。

SOB培養(yǎng)基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5gNaCl，高壓滅菌。另外準(zhǔn)備2mol/L鎂溶液（1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻，過(guò)濾滅菌），臨用前加1ml于100ml培養(yǎng)基。

SOC培養(yǎng)基（100ml）：臨用前加入1ml過(guò)濾滅菌的2mol/L葡萄糖。

目的基因 | 核酸的分離與純化

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