免疫熒光
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免疫熒光（immunofluorescence technic）
免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術（fluorescentantibodytechnique）。 用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質結合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術，或稱為免疫熒光技術。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術。
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技術特點
該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。
熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產。
由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。近年來發展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。
原理
免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。
直接法
將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
間接法
如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原—抗體—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發生反應，因此，制備標記抗體適用于雞任何抗原的診斷。
技術分類
⑴ 熒光抗體技術(熒光顯微鏡技術)
抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。
⑵ 免疫熒光測定技術
抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法
（1）熒光物質
1）熒光色素
許多物質都可產生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
(1)異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發射光波長520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：
有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。
(2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩定，可長期保存。結構式如下：
最大吸收光波長為570nm，最大發射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。
(3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：
最大吸引光波長為550nm，最大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。
（2）其他熒光物質
1）酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發出熒光，激發光波長為360nm，發射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
2）鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經激發后也可發射特征性的熒光，其中以Eu3 應用最廣。Eu3
螯合物的激發光波長范圍寬，發射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。
常見熒光素
1）FITC
2）RB200
3）TRITC
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE
6）其它
常見熒光素的特性
1）FITC：黃色結晶粉末，吸收光：490~495nm，發射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。
2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發射光 595~600nm，橘紅色熒光。
3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發射光 620nm，橙紅色熒光。
4）鑭系：Eu、Tb
5）PE：吸收光490~560nm，發射光 595nm，紅色熒光。
6）其它：酶作用后產生熒光物質。
酶作用后產生熒光物質
酶 底物 產物 激發光 發射光
Β-G MUG MU 360 450
AP MUP MU 360 450
HRP HPA 二聚體 317 414
（4）合適熒光素的選擇
1）具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團。
熒光素-N=C +NH-蛋白質 熒光素-N-C-N-蛋白質
‖ ︱ ︱‖ ︱
S H H S H
2）熒光效率高，標記后下降不明顯。
3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。
5）標記方法簡單、快速。
6）安全無毒
免疫熒光技術的實驗步驟
1. 直接免疫熒光法測抗原
（1）基本原理
將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
（2）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（3）實驗步驟
① 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕度。
② 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫一定時間（參考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時振蕩。
④ 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
⑤ 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：
（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。
（4）注意事項
1)對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。
2)染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10 min到數小時，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。
3)為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
① 標本自發熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
② 特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。
③ 陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。
如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
4)一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本最好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。
2.間接免疫熒光法測抗體
（1）基本原理
染色程序分為兩步，第一步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體。第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定未知抗體。
（2）試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
熒光標記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋 。
搪瓷桶三只（內有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內鋪一層浸濕的紗布墊）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
（3）實驗步驟
1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。
2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
3)取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩 。
4)取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。
5)將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。
6)重復操作3。
7)取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結果判定同直接法。
（4）注意事項
1)熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。
2)每次試驗時 ，需設置以下三種對照：
① 陽性對照：陽性血清+熒光標記物
② 陰性對照：陰性血清+熒光標記物
③ 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
3. 已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。
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