顯微技術(shù)
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顯微技術(shù)（microscopy）是利用光學(xué)系統(tǒng)或電子光學(xué)系統(tǒng)設(shè)備，觀察肉眼所不能分辨的微小物體形態(tài)結(jié)構(gòu)及其特性的技術(shù)，包括：①各種顯微鏡的基本原理、操作和應(yīng)用的技術(shù)；②顯微鏡樣品的制備技術(shù)；③觀察結(jié)果的記錄、分析和處理的技術(shù)。
目錄 |
光學(xué)顯微鏡的產(chǎn)生和發(fā)展
原始的光學(xué)顯微鏡是一個(gè)高倍率的放大鏡。據(jù)記載，在1610年前意大利物理學(xué)家伽利略已制作過復(fù)式顯微鏡觀察昆蟲的復(fù)眼。這是一種已具目鏡、物鏡和鏡筒等裝置，并固定在支架上的顯微鏡。荷蘭人 A.van.列文虎克一生制作了不少于247架顯微鏡，觀察了許多細(xì)菌、原生動(dòng)物和動(dòng)、植物組織，是第一個(gè)用顯微鏡作科學(xué)觀察的人。到18世紀(jì)顯微鏡已有許多改進(jìn)，應(yīng)用比較普遍，已作為一種商品進(jìn)行生產(chǎn)。
1872～1873年，德國物理學(xué)家和數(shù)學(xué)家E.阿貝提出了光學(xué)顯微鏡的完善理論，從此，鏡頭的制作可按預(yù)先的科學(xué)計(jì)算進(jìn)行。同時(shí)，德國化學(xué)家O.肖特成功地研制出供制作透鏡的優(yōu)質(zhì)光學(xué)玻璃。他們和德國顯微鏡制作家卡爾.蔡司合作，建立了蔡司光學(xué)儀器廠，于1886年生產(chǎn)出具復(fù)消色差油鏡的現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡，達(dá)到了光學(xué)顯微鏡的分辨限度。從19世紀(jì)后期至20世紀(jì)60年代發(fā)展了許多類型的光學(xué)顯微鏡，如：偏光顯微鏡、暗視場顯微鏡、相差顯微鏡、干涉差顯微鏡、熒光顯微鏡。此外，還有許多特殊裝置的顯微鏡，例如在細(xì)胞培養(yǎng)中特別有用的倒置顯微鏡。20世紀(jì)80年代后期又發(fā)展了一種同焦掃描激光顯微鏡，結(jié)合圖象處理，可以直接觀察活細(xì)胞的立體圖，是光學(xué)顯微鏡的一大進(jìn)展。
電子顯微鏡的產(chǎn)生和發(fā)展
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934年由M.諾爾和E.魯斯卡在柏林制造成功第一臺(tái)實(shí)用的透射電子顯微鏡。其成象原理和光學(xué)顯微鏡相似，不同的是它用電子束作為照射源，用電子透鏡代替玻璃透鏡，整個(gè)系統(tǒng)在高真空中工作。由于電子波長很短，所以分辨率大大提高。在電鏡制作的實(shí)驗(yàn)階段就曾嘗試觀察生物材料。1934年布魯塞爾大學(xué)的L.馬頓在美國就發(fā)表過用鋨酸固定的茅膏菜植物葉子切面的電鏡圖。1949年A.克勞德、K.R.波特和E.皮克爾斯獲得了第一張細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的電鏡圖。到20世紀(jì)50年代，透射電子顯微鏡在生物學(xué)的研究中已被廣泛的應(yīng)用。分辨率已由最初的500埃提高到小于2埃。
20世紀(jì)50年代掃描電子顯微鏡在英國首先制造成功。它是利用物體反射的電子束成象的，相當(dāng)于光學(xué)顯微鏡的反射象。掃描電子顯微鏡景深大，放大倍率連續(xù)可變，特別適用于研究微小物體的立體形態(tài)和表面的微觀結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)70年代以來，掃描電鏡發(fā)展很快，在固體樣品上可反射多種電子，結(jié)合信號(hào)分析裝置，已成為研究物質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的有力工具。掃描電鏡的分辨率已由最初的500埃提高至50～30埃。電子顯微鏡的另一個(gè)發(fā)展是研制超高壓電鏡以增加分辨率和對原樣品的穿透力。制成了3兆伏的加速電壓的超高壓電鏡，可用來研究整體細(xì)胞和物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)象或原子結(jié)構(gòu)象。
顯微樣品制備技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展
1665年國顯微鏡學(xué)家R.胡克把軟木切成薄片才在顯微鏡下觀察到細(xì)胞。列文虎克在1714年用藏紅花作肌纖維切片的染色，這一簡單的切片和染色可以說是制片技術(shù)的萌芽。從18世紀(jì)20年代開始，德國一些研究工作者在染料的發(fā)展上作出了很大的貢獻(xiàn)；而英國一些顯微鏡學(xué)家則熱心于制片技術(shù)的研究。經(jīng)過100多年的實(shí)踐，至19世紀(jì)中期顯微制片技術(shù)才逐漸完善。1863年W.瓦爾代爾報(bào)告了用蘇木精染色可以很好地顯示染色體。1869年E.克萊布斯最先采用石蠟作為切片支持物來包埋材料。兩年后，波姆和斯特里克勒把它發(fā)展為石蠟切片法。雖然早在1770年國人卡明斯設(shè)計(jì)制作了切片機(jī)，但完善的轉(zhuǎn)動(dòng)式切片機(jī)直到1883年才由法伊弗在美國制造成功。這些重要的制片手段仍在使用。
透射電鏡樣品制作的原理和操作與顯微制片相似。1952年G.E.帕拉德采用緩沖的四氧化鋨為固定劑獲得良好的電鏡圖象，這一方法一直在延用。1949年紐曼采用二甲烯丙酸酯作為電鏡樣品切片的介質(zhì)，獲得了初步成功，后來改用了更合適的塑料，如環(huán)氧樹脂Epon812。1953年K.R.波特和布盧姆首先采用了切超薄切片的超薄切片機(jī)，1950年拉塔和哈特曼偶然發(fā)現(xiàn)玻璃刀適合于超薄切片，從此玻璃刀成了電鏡切片的主要用刀，并且還在使用。當(dāng)然費(fèi)爾南德斯-莫蘭發(fā)明的砧石刀效果更好，并且是制作連續(xù)切片所必不可少的。1950年吉本斯和布雷德菲爾德證明電子圖象的細(xì)節(jié)可由重金屬染色而增強(qiáng)，從而發(fā)展了廣泛使用的電子染料。
掃描電鏡的樣品制備比較簡單。干燥的樣品僅需金屬涂膜使樣品表面導(dǎo)電即可觀察。生物材料一般需要固定、脫水、干燥和涂膜等步驟。此外，還可對所觀察的對象進(jìn)行各種手術(shù)，這種在顯微鏡下操作的技術(shù)稱為顯微操作。
觀察結(jié)果的記錄、分析和處理
顯微鏡及電子顯微鏡下所見顯微圖象及其顯示的信息是被觀察物體和輻射波之間相互作用的效應(yīng)，有些信息是可以直接用肉眼看到和識(shí)別的，有些則不能直接看到和識(shí)別。因此對顯微技術(shù)所獲得的信息的接收、分析和處理就十分重要。
光學(xué)顯微鏡所觀察到的圖象可為肉眼所接受和識(shí)別。這種直接觀察的結(jié)果用描圖儀依象勾畫，即可記錄；用顯微攝影、顯微電影或錄像，則可更正確地記錄。但在電子顯微鏡發(fā)展至高分辨率后，對極精細(xì)的結(jié)構(gòu)，如對物質(zhì)的分子或原子結(jié)構(gòu)圖的接收和解釋，就會(huì)遇到許多困難，因?yàn)閳D象和樣品的真實(shí)情況之間，在接收和顯示中可能發(fā)生各種誤差，不加校正和分析就無法獲得理想的圖象或作出正確的解釋。這種對電子圖象進(jìn)行處理和分析的技術(shù)已發(fā)展成為一個(gè)專門的學(xué)科：生物圖像處理技術(shù)。顯微技術(shù)愈是深入的發(fā)展，圖象處理技術(shù)愈益重要。
顯微技術(shù)的應(yīng)用
18～19世紀(jì)顯微技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了生物學(xué)，特別是細(xì)胞學(xué)的迅速發(fā)展。例如，19世紀(jì)后葉細(xì)胞學(xué)家對受精作用、染色體的結(jié)構(gòu)和行為的研究，就是在不斷改進(jìn)顯微技術(shù)的過程中取得很大成就的，而這些成就又為細(xì)胞遺傳學(xué)的建立和發(fā)展打下了基礎(chǔ)。此外，顯微技術(shù)在細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)、植物解剖學(xué)、微生物學(xué)、古生物學(xué)及孢粉學(xué)發(fā)展中，已成為一個(gè)主要研究手段。
電子顯微鏡的發(fā)明促使生物學(xué)中微觀現(xiàn)象的研究從顯微水平發(fā)展到超顯微水平。超微結(jié)構(gòu)的研究結(jié)合生物化學(xué)的研究，使以形態(tài)描述為主的細(xì)胞學(xué)發(fā)展成為以研究細(xì)胞的生命活動(dòng)基本規(guī)律為目的細(xì)胞生物學(xué)。
20世紀(jì)70年代以來，由于電子顯微鏡分辨率的不斷提高并與電子計(jì)算機(jī)的結(jié)合應(yīng)用，許多分子生物學(xué)的現(xiàn)象，例如DNA的轉(zhuǎn)錄、DNA分子雜交等在生物化學(xué)中用同位素技術(shù)可證實(shí)的現(xiàn)象，也可在電子圖象中獲得直觀的證實(shí)，許多生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能也可從電子圖象的分析中加以認(rèn)識(shí)。總之，利用顯微技術(shù)進(jìn)行的生物學(xué)研究可以反映細(xì)胞水平、超微結(jié)構(gòu)水平，甚至分子水平三個(gè)不同的層次的信息。三者各具特點(diǎn)，同時(shí)又是相互聯(lián)系和相互補(bǔ)充的。
在醫(yī)療診斷中，顯微技術(shù)已被用為常規(guī)的檢查方法，如對血液、寄生蟲卵、病原菌等的鏡檢等。利用顯微技術(shù)作病理的研究已發(fā)展為一門專門的學(xué)科——細(xì)胞病理學(xué)，它在癌癥的診斷中特別重要。某些遺傳病的診斷，已離不開用顯微技術(shù)作染色體變異的檢查。此外，在衛(wèi)生防疫、環(huán)境保護(hù)、病蟲害防治、檢疫、中草藥鑒定、石油探礦和地層鑒定、木材鑒定、纖維品質(zhì)檢定、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、礦物學(xué)以及其它工業(yè)材料和工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量檢查等方面，都有廣泛的應(yīng)用。
展望
從20世紀(jì)70年代以來的發(fā)展趨勢看，顯微技術(shù)的進(jìn)展將體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
①技術(shù)上將更快地向定量顯微術(shù)方向發(fā)展；
②在儀器上不論是光學(xué)顯微鏡還是電子顯微鏡，都將從單一功能的儀器向多功能組合的大型儀器發(fā)展；
③在操作上將在更大程度上引入電子學(xué)技術(shù)，從而向更高的自動(dòng)化操作發(fā)展；
④圖象分析技術(shù)將迅速地在顯微技術(shù)中廣泛的應(yīng)用；
⑤設(shè)法解決在超微結(jié)構(gòu)水平上作活體的觀察。曾經(jīng)嘗試創(chuàng)制高分辨率的X射線顯微鏡來觀察活體，但還沒有獲得理想的結(jié)果。
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