核移植
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所謂細胞核移植技術(shù)，就是將供體細胞核移入除去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)過精子穿透等有性過程即無性繁殖即可被激活、分裂并發(fā)育成新個體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。以供體核的來源不同可分為胚細胞核移植與體細胞核移植兩種。
【哺乳動物核移植技術(shù)研究進展】
哺乳動物核移植是將外源的一個細胞核與一個去核卵母細胞結(jié)合，產(chǎn)生遺傳上同質(zhì)的動物的技術(shù)。它在動物育種、制備轉(zhuǎn)基因動物、基因治療及器官移植等方面具有重大的作用。
具體方法
『1 供體核的獲得』
供體核可以是早期胚胎細胞、胚胎千細胞和體細胞。早期都采用合子核到64細胞期的胚胎細胞核質(zhì)體分裂球作供體細胞核，80年代開始，隨著胚胎干細胞（embryo stem cells，ES)的建立和對其研究的深入，人們對胚胎干細胞在核移植方面的應(yīng)用前景寄予厚望，但ES建系太困難，僅在小鼠上獲得成功。Teruhiko Wakayama等利用ES系克隆小鼠，結(jié)果有29％的重構(gòu)胚在體外能發(fā)育到囊胚階段，移植給假孕小鼠有8％胚胎附植并產(chǎn)下小鼠。1997年Dolly羊的出現(xiàn)，開始了體細胞的核移植，并發(fā)展很快。
1.1 胚細胞
用0.2％鏈霉蛋白酶預(yù)處理胚胎，溶去胚胎的膠膜及透明帶，分離出單個卵裂球。消化透明帶的時間是影響卵裂球質(zhì)量的重要因素，作用時間短，透明帶不能充分消化，卵裂球不易獲得；作用時間長，則影響到卵質(zhì)膜，容易破裂，在操作時容易失敗。因此，在分離卵裂球時應(yīng)在解剖鏡下監(jiān)視透明帶的消化過程，當透明帶變薄，膨脹適度時就應(yīng)移出，再用適當口徑的吸管吹打使之分離。另外，蘇格蘭學者Campbell等顯微分離胚盤細胞并在體外進行缺血饑餓傳代培養(yǎng)，誘使細胞處于“靜止”狀態(tài)，以便調(diào)整染色體結(jié)構(gòu)，從而有助于核的重組與發(fā)育，他們使用這種方法建立了綿羊TNT4細胞系，該細胞形態(tài)類似于胚胎干細胞，但更扁平、上皮化。
1.2 體細胞
最早用青蛙腸粘膜上皮細胞獲得了后代。Wilmut等用綿羊乳腺細胞獲得Dolly羊。美國夏威夷大學Ryuzo Yanagimachi教授領(lǐng)導的一個國際科研小組于1998年以小鼠卵丘細胞為核供體，采用吸移管注入，利用機械和化學激活方式進行細胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。對小鼠、牛體細胞移植的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)休眠(G0)的顆粒細胞核與去核MⅡ期卵母細胞構(gòu)成的體細胞重構(gòu)胚，其發(fā)育率及產(chǎn)生克隆后代的能力遠高于其它類型的休眠體細胞，這可能緣于顆粒細胞上存在著與卵母細胞緊密聯(lián)系的胞質(zhì)微絨毛橋的緣故，它或許有助于供體核同受體核胞質(zhì)因子的交換。
『2 受體細胞的獲得及其去核』
作為細胞核移植的受體細胞主要有三類：去核的卵母細胞、受精卵和2-細胞胚胎，其中卵母細胞應(yīng)用最為廣泛。近來有人用兩個去核卵母細胞融合后產(chǎn)生的胞質(zhì)作為受體進行各代核移植，以增加核移植胚胎的細胞數(shù)和提高繼代移植效率。研究證明，體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞核移植成功率不如體內(nèi)成熟的卵母細胞，其原因可能是卵母細胞在體外成熟過程中，需要合成一些蛋白質(zhì)來完成第一次減數(shù)分裂，體外成熟的一些卵母細胞其活動有可能受到抑制。
2.1 卵母細胞的去核方法
2.1.1 盲吸法 用微細玻璃管在第一極體下盲吸，吸除第一極體及處于分裂中期的染色體和周圍的部分細胞質(zhì)，但該方法成功率低。為提高去核率，利用Hoechst33342染料對染色質(zhì)的特異性染色作用，在熒光顯微鏡下去核后判斷去核是否完成，去核準確率大為提高。Stice等用Hoechst33342(1μg/ml)染色，在紫外線下照射的時間控制在10s以內(nèi)，未觀察到對胚胎發(fā)育的負面影響。
2.1.2 半卵法 用微細玻管針在透明帶上做一切口后，用微細玻管吸去一半染色質(zhì)至另一半空透明帶內(nèi)，即將卵母細胞分為兩半，然后用Hoechst33342染色，確定不含染色體的一半為細胞質(zhì)受體。其操作方法如下，將卵母細胞移入35mm含有mPBSA(磷酸緩沖液，其中有D-葡萄糖1OOOmg/l、丙酮酸36mg/l、0.4％牛血清白蛋白、1％青霉素和鏈霉素10000μg/ml)的皮氏培養(yǎng)皿中進行顯微操作，首先分兩步進行分割透明帶，即先在透明帶上切一小口，然后用另一切割針擴大切口，從而分割透明帶。透明帶被切除后轉(zhuǎn)移到含有mPBSA+5μg/ml細胞松弛素B的35mm的皮氏培養(yǎng)皿中作用3一5min，然后用固定針(內(nèi)徑為透明帶的l/5一1/3，外徑接近透明帶的直徑)固定，分割針進入透明帶的隙口中并將該針固定在靠著透明帶的地方，緩慢吸取卵母細胞液，當分割針中吸取了一半卵母細胞液時，這時將該針從卵黃隙中移出，并靠著透明帶切割邊緣輕微地擦過以達到完全的分割，將其針中的卵母細胞液移入準備好了的空透明帶中，并用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀察不發(fā)熒光的作為受體卵母細胞。
2.1.3離心去核 Tatham等以150OOg、2min離心牛卵母細胞，用鏈霉蛋白酶去除卵母細胞透明帶(ZP)，經(jīng)滲透壓梯度離心，MⅡ期紡錘體可從大多數(shù)卵母細胞中分開，把無透明帶的去核胞質(zhì)作核移植的供質(zhì)，同分裂球聚集經(jīng)電融合成核移植胚，最后放入藻酸鈉假透明帶中，能在體外卵裂和發(fā)育，但其效果還有待于進一步研究。
2.1.4 末Ⅱ期去核法 Bordignon等提出把卵母細胞先激活使之處于末Ⅱ期，在排出第二極體時吸出第二極體及周圍的少量細胞質(zhì)，從而達到去核。這種方法避免使用DNA染料和經(jīng)紫外線照射來定位染色體，并且去除的細胞質(zhì)相對較少。該去核方法比MⅡ期去核的成功率有顯著提高，但這種細胞質(zhì)容易老化，是否能對基因組完全重排序，順利完成后期發(fā)育，有待于研究。
2.2 去核時間與去核成功率
多數(shù)研究者在多數(shù)卵母細胞出現(xiàn)第一極體的成熟時期去核，去核時間，體內(nèi)成熟在發(fā)情開始后48h，體外成熟22－24h。卵母細胞去核程序與重構(gòu)胚中再程序化狀況密切相關(guān)，去核率越高，其克隆胚最終發(fā)育成正常胚的可能性越大。去核率的高低與卵母細胞所處的成熟時期以及所采用的方法密切相關(guān)。以前的核移植研究均采用未激活的卵母細胞作為核受體，并認為激活后卵母細胞的重排能力會下降，影響核移植的效率。但Ushijima，等和Terlovw等；研究表明，激活后的卵母細胞作為核供體時，重構(gòu)胚融合和發(fā)育能力均優(yōu)于融合激活同時進行的效果。
2.3 胞質(zhì)容士與重構(gòu)胚的發(fā)育潛力
有人對核反比例與重構(gòu)胚發(fā)育的關(guān)系進行研究，結(jié)果表明，卵母細胞去除的胞質(zhì)量與預(yù)期供核體積大小相當時，可以為細胞周期的相互作用創(chuàng)造最好的條件，而去除太少或太多并不理想。基于去除細胞質(zhì)的量與去核率關(guān)系密切，因此，在保證有較高的去核情況下。去除的胞質(zhì)應(yīng)盡量少。
『3 核卵重組』
在顯微操作儀操縱下，用一直徑接近卵裂球大的移植針吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核的受體卵母細胞的間隙中，根據(jù)移人的部位不同，可分為帶下移植和細胞質(zhì)內(nèi)注射。那些卵裂球很難分離的胚胎可以在添有鈣和鎂-游離的磷酸緩沖鹽溶液的mPBSA中孵育30－6Omin使細胞分裂停止。但孵育時間超過6Omin，細胞膜的完整性將遭到破壞，操作過程中細胞的溶化率將增加。在移植針移開后，對移植卵裂球上方的透明帶施加壓力使卵裂球與半卵母細胞接觸。
『4 細胞融合/激活』
4.1 融合與激活
由于微吸管破壞了卵膜和一部分細胞質(zhì)，若直接移植，成功率很低，故需對重組胚融合，其采用的方法有仙臺病毒法、電融合法，后者更常用。電融合時選擇的電壓范圍和脈沖頻率取決于融合箱中兩個電極的距離。融合箱的距離由2OOμm，到幾毫米，因此在脈沖是200μsec倍數(shù)且能傳導lKV/cm的直流電基本滿足要求。對小鼠、家兔等實驗動物進行胚胎核移植時還發(fā)現(xiàn)，受體卵母細胞在重構(gòu)胚電融合時被激活的狀態(tài)與重購胚的發(fā)育率密切相關(guān)，脈沖強度為2.0-3.6K/cm、融合時間為60-2OOμsec是適宜范圍。若脈沖過強，融合時間過長，對重構(gòu)胚的進一步發(fā)育極為不利。Kono等提出針對不同時期的供體核采取不同激活程序得到了較好的實驗結(jié)果:①對于G2期和M期的供體核即4倍DNA供體，在融合時可采用不引起卵母細胞活化的仙臺病毒或細胞質(zhì)內(nèi)注射，然后再給予激活處理，使一半DNA以極體方式排出，隨后形成原核及正常2倍體細胞，應(yīng)用此法已產(chǎn)生了正常的小鼠；②對于G0、G1及S期供體核，可采用融合前激活和融合時激活兩種方式，以防止供體核形成中期板而導致染色體的不正常。Szollosi用小鼠胸腺細胞作核移植實驗時發(fā)現(xiàn)，只有成熟的去核卵母細胞被激活前或激活后3Omin進行融合，移入的供體細胞核才發(fā)生降解，并重新聚合形成新核膜，若超過3Omin再觸合，雖然移入的供體核才發(fā)生降解，這可能會使供體染色質(zhì)與受體細胞質(zhì)諸因子的有效互作受到抑制，從而使再程序化過程受阻。Wakayama等人利用受體卵母細胞化學激活和重構(gòu)胚化學融合的方法，也在小鼠體細胞克隆和再克隆的研究中取得了理想的結(jié)果。
對兔卵電融合完成后，卵母細胞也因電刺激受到激活從而開始新的編程和發(fā)育，但對小鼠、大鼠和牛等還需進一步充分的激活才能獲得發(fā)育。其方法有化學和電激活兩種，化學激劑有7％乙醇、Ionomycin(離子霉素)、鈣離子載體A23187，采用Ionomycin激活后再用6-DMAP處理3h，可避免出現(xiàn)PCC(早熟染色體凝集)，并增加羊重構(gòu)胚的發(fā)育率及出生率。
4.2 融合率與細胞期
Prather等(1989)研究結(jié)果表明，融合率與細胞期無顯著差異，說明卵裂球的體積變小對融合率并無顯著的影響，張涌(1992)在小鼠研究中也得出類似的結(jié)果。Robal等也認為，融合率與受體卵母細胞的時齡有關(guān)，并且還與核供體接觸的面積和接觸的緊密程度有關(guān)，而與移入的卵裂球處于什么時期無關(guān)，但是重構(gòu)胚的發(fā)育率與供體胚的細胞期是有關(guān)的。
4.3 溫度、卵母細胞成熟時間對卵母細胞激活的影響
隨著卵母細胞在體外成熟時間的延長，進而老化，成熟促進因子（MPF）下降，易激活。體外成熟老化的牛卵母細胞對溫度誘導激活高度繁感，在一定的溫度誘導激活下，卵母細胞染色質(zhì)聚縮，“自動去核”的頻率高。幼稚卵母細胞不容易在室溫下激活，即使激活也不穩(wěn)定，可能逆轉(zhuǎn)到中期。
『5 重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植』
重構(gòu)胚需一定時間的培養(yǎng)，方可移植到受體，家兔和豬重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)24h以內(nèi)，就可通過非手術(shù)移植，而羊和牛重構(gòu)胚所需培養(yǎng)時間較長，一般發(fā)育到囊胚或桑堪胚時移植。培養(yǎng)的方法是可將電融合的重構(gòu)胚放大1O％FCS的RD微滴內(nèi)培養(yǎng)，也可將顯微操作的胚胎移入同種或異種的輸卵管中進行培養(yǎng)，幾天后沖洗輸卵管，回收重構(gòu)胚。后者的實驗方法如下，先用瓊脂和0.9％NaCI制成1.0％和1.2％瓊脂糖，將1.0％的瓊脂倒入35mm的皮氏培養(yǎng)皿中，當溫度為37℃時將胚胎移入瓊脂塊中。應(yīng)用瓊脂切割針吸取一氣泡和mPBSA+20％新生犢牛血清，然后吸取含有瓊脂的胚胎，該針在室溫下保持幾秒鐘后將其放入MPBSA+20％新生犢牛血清的皮氏培養(yǎng)皿中。當1.2％的瓊脂溫度達到37℃時，采用同上的方法在瓊脂糖中洗滌幾次，然后組成雙層瓊脂并采用手術(shù)移植到輸卵管中。在體外進行重構(gòu)胚的培養(yǎng)時，選擇適當?shù)?a href="/index.php?title=%E5%9F%B9%E5%85%BB%E6%B6%B2&action=edit&redlink=1" class="new" title="培養(yǎng)液（尚未撰寫）" rel="nofollow">培養(yǎng)液非常重要。重構(gòu)胚的移植與胚胎移植的方法基本一樣，即根據(jù)受體動物的不同可分為手術(shù)移植和非手術(shù)移植。
『6 結(jié) 語』
到目前為止，雖然核移植技術(shù)的發(fā)展較快，然而該技術(shù)還存在許多問題，如核移植成功率普遍比較低、重構(gòu)胚的發(fā)育率低、畸形胚的比率高。體外培養(yǎng)的時間過長或培養(yǎng)液的成份可能導致移植胚的流產(chǎn)以及出生后的仔畜很快死亡。基因重組編程的機制尚不清楚，其中MPF、NEBD(核膜破裂)和PCC在基因組重編過程的作用還需闡明。基因印記對核移植重新編程的影響以及基因印記與動物克隆技術(shù)的成功及不足有何關(guān)系，還不清楚。
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