沉降系數(shù)
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沉降系數(shù)（sedimentation coefficient）
用離心法時，大分子沉降速度的量度，等于每單位離心場的速度。或s=v/ω2r。s是沉降系數(shù)，ω是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。沉降系數(shù)以每單位重力的沉降速度表示，（the velocity per unit force）并且通常為1～200×10-13秒范圍，10-13這個因子叫做沉降單位S，即1S=10-13秒沉降系數(shù)越大在離心時候越先沉降。如血紅蛋白的沉降系數(shù)約為4×10-13秒或4S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。
目錄 |
定義
沉降系數(shù)（sedimentation coefficient，s）
根據(jù)1924年Svedberg（離心法創(chuàng)始人--瑞典蛋白質(zhì)化學(xué)家）對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。
To call the parameter which characterizes the movement of the particle at the centrifugal force place。
沉降系數(shù)是以時間表示的。
蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子的S實(shí)際上時常在10的-13次秒左右，故把沉降系數(shù)10的-13次秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。
[ Adopted unit ] second
[ Another unit ] 1 svedberg = 1E(-13) sec
[ SI unit ] second
因隨溶劑的種類、溫度的變化而變化，所以通常是換算成20℃純水中的數(shù)值，進(jìn)一步算出分子間無作用力和濃度為零時的外插值。沉降系數(shù)是以分子量、分子形狀和水等情況來決定，其作為生物體大分子的一個特征是很重要的。
測定
沉降系數(shù)通過分析離心機(jī)測定。
通常只需要幾十毫克甚至幾十微克樣品，配制成1~2毫升溶液，裝入分析池，以幾小時的分析離心，就可以獲得一系列的樣品離心沉降圖。根據(jù)沉降圖可以作樣品所含組分的定性分析，亦可以測定各組分的沉降系數(shù)和估計分子大小，作樣品純度檢定和不均一性測定，以組分的相對含量測定。
測定原理
沉降系數(shù)的測定原理就是在恒定的離心力場下測定樣品顆粒的沉降速度。
因?yàn)闃悠奉w粒很小，不能直接看到它們的沉降運(yùn)動，所以把離心時樣品顆粒的界面移動速度看作是樣品顆粒的平均沉降速度。通常使用Schlieren和吸收光學(xué)系統(tǒng)來記錄界面沉降圖。在沉降圖中樣品界面一般表現(xiàn)為一個對稱的峰，峰的最高點(diǎn)代表界面位置。
通常沉降系數(shù)測量精度為±2%,但是如果面界圖型表現(xiàn)為不對稱峰型，或希望沉降系數(shù)測量精度達(dá)到±1%或更小的情況時，按峰的最高點(diǎn)作為界面位置就不夠了這時應(yīng)該使用二階距法計算界面位置。
基本原理
物體圍繞中心軸旋轉(zhuǎn)時會受到離心力F的作用。當(dāng)物體的質(zhì)量為 M、體積為V、密度為D、旋轉(zhuǎn)半徑為r、角速度為ω（弧度數(shù)/秒）時，可得：
F=Mω2r 或者 F=V.D.ω2r （1）
上述表明：被離心物質(zhì)所受到的離心力與該物質(zhì)的質(zhì)量、體積、密度、離心角速度以及旋轉(zhuǎn)半徑呈正比關(guān)系。離心力越大，被離心物質(zhì)沉降得越快。
在離心過程中，被離心物質(zhì)還要克服浮力和摩擦力的阻礙作用。浮力F｝和摩擦力F｝｝分別由下式表示：
F’=V.D’.ω2r （2）
F’’=f dr/dt （3）
其中D｝為溶液密度，f為摩擦系數(shù)，dr/dt為沉降速度（單位時間內(nèi)旋轉(zhuǎn)半徑的改變）。
基本原理
在一定條件下，可有 ：
F=F’+F’’
V.D. ω2r =V.D’ω2r + f. dr/dt
dr/dt =Vω2r (D-D’)/f (4)
式(4)表明，沉降速度與被離心物質(zhì)的體積、密度差呈正比，與f成反比。若以S表示單位力場（ω2r=1）下的沉降速度，則
S=V (D-D’)/f
S即為沉降系數(shù)。
沉降系數(shù)對于生物大分子來說，多數(shù)在(1~500)×10-13秒間。為應(yīng)用方便起見，人們規(guī)定1×10-13秒為一個單位（或稱1S）。一般單純的蛋白質(zhì)在1~20S之間，較大核酸分 子在4~100S之間，更大的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)在30～500S之間。
以蛋白質(zhì)為例溶液中的蛋白質(zhì)在受到強(qiáng)大的離心作用時，如果蛋白質(zhì)溶液的密度大于溶劑的密度，蛋白質(zhì)分子就會下沉，在離心場中，蛋白質(zhì)分子所受到的凈離心力（離心力減去浮力）與溶劑的摩擦力平衡時，每單位離心場強(qiáng)度定值，這個定值即為沉降系數(shù)（sedimentation coefficient）。沉降速度用每單位時間內(nèi)顆粒下沉的距離來表示。
測定方法
⑴樣品：蛋白質(zhì)
⑵樣品溶液與離心：將樣品溶于緩沖液中，用一定規(guī)格的雙槽分析池，一邊加入溶液一邊加入溶劑。分析池與平衡池平衡重量，使平衡池比分析池輕0.5g以內(nèi)，然后分別裝入分析轉(zhuǎn)頭。抽真空。開Schlieren光光源，選擇工作速度，室溫離心。轉(zhuǎn)動腔達(dá)到真空后離以機(jī)開始運(yùn)轉(zhuǎn)加速，此時在觀察窗口可以看到離心圖型。達(dá)到工作速度后恒速離心。
以蛋白質(zhì)為例待看到樣品峰的尖端后即可以間隔照相。照完相即可關(guān)機(jī)，取出樣品液，清理轉(zhuǎn)頭和分析池。照相用強(qiáng)反差顯影沖洗后即得Schlieren光路沉降圖形照片。
⑶沉降圖像測量：Schlieren沉降圖可以用比長儀，讀數(shù)顯微鏡，或投影儀測量。測量時把沉降圖像的底片放于測量儀器上，使液面的垂直線與測量儀中的垂直線重合，然后用十字標(biāo)線依次測量內(nèi)參孔，液面，界面峰尖，和外參考孔的位置，每個圖像至少讀測三次，取平均值。依次把每個圖像依同樣方法測量，把數(shù)據(jù)列成表。
(4)沉降系數(shù)S的計算：代入公式計算。
圖像分析
當(dāng)離心剛開始時如果見到有快速沉降的峰，幾分鐘內(nèi)就到達(dá)分析池底部，一般多是由于樣品發(fā)生部分聚合形成快速沉降的高聚物。離心達(dá)速后樣品的的記心圖像顯示一個對稱的峰形，一般可以認(rèn)為樣品是離心均一的。但是對樣品的真正均一性還應(yīng)用其他方法進(jìn)一步檢測，如電泳，層析等。某些混合樣品偶然亦會給出一個對稱峰的。峰形通常會隨時間而擴(kuò)展，這是由于樣品擴(kuò)散的結(jié)果。但如果峰形擴(kuò)展很快，則該樣品可能是多分散性的。如果離心圖像中表現(xiàn)幾個峰，說明樣品中有幾個組分，每一個峰代表相應(yīng)組分的沉降界面，因此可以測定每一個組分的沉降系數(shù)值。根據(jù)峰的面積可以測量組分的濃度值。
有時離心的圖像表現(xiàn)出一個不對稱的峰，這可能是由于下列幾種情況所致。①幾個沉降系數(shù)接近的組分峰形重疊，②樣品是多分散性的，其分子量分布不均勻，③某些相互作用強(qiáng)的高分子，其沉降速度對濃度依賴很大。若測定于高濃度，在界面區(qū)由于濃度變化造成沉降速度不一致而致峰形呈不對稱分布
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