高效液相色譜儀
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高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí), 經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過(guò)程, 各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出, 通過(guò)檢測(cè)器時(shí), 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。
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高效液相色譜
（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。
高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對(duì)其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密；由于液體流動(dòng)相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長(zhǎng)度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個(gè)領(lǐng)域。
使用高效液相色譜時(shí)，液體待檢測(cè)物被注入色譜柱，通過(guò)壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開(kāi)色譜柱，通過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，最后通過(guò)分析比對(duì)這些信號(hào)來(lái)判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒(méi)有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效微粒固定相，適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。
發(fā)展歷史
1960年代，由于氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開(kāi)發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開(kāi)啟了高效液相色譜的時(shí)代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成。
1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書(shū)，標(biāo)志著高效液相色譜法 (HPLC)正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測(cè)手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)與檢測(cè)、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料、檢測(cè)技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。
1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨著困境，后來(lái)的研究人員便采用微粒固定相來(lái)突破著一瓶頸。科克蘭、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實(shí)現(xiàn)了高速傳質(zhì)，為高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基礎(chǔ)。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實(shí)現(xiàn)。1960年代研制出氣動(dòng)放大泵、注射泵及低流量往復(fù)式柱塞泵，但后者的脈沖信號(hào)很大，難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代，往復(fù)式雙柱塞恒流泵，解決了這一問(wèn)題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠，平均粒徑只有7μm，具有極好的柱效，并逐漸取代了無(wú)定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高，多次使用成為可能。1970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點(diǎn)。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問(wèn)題，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到改變流動(dòng)相的組成事提高選擇性的關(guān)鍵。
高效液相色譜的特點(diǎn)
高壓——壓力可達(dá)150～300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。
高速——流速為0.1～10.0 mL/min。
高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。
高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。
HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：
速度快——通常分析一個(gè)樣品在15～30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。
色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
高效液相色譜儀的應(yīng)用
高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液, 不受樣品揮發(fā)性的限制,流動(dòng)相可選擇的范圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。
與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合,HPL C 所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度, 使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能,能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展, 有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。
HPL C 成為解決生化分析問(wèn)題最有前途的方法。由于HPL C具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用, 流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無(wú)機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。
液相色譜- 質(zhì)譜連用技術(shù)受到普遍重視, 如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等; 液相色譜- 紅外光譜連用也發(fā)展很快,如在環(huán)境污染分析測(cè)定水中的烴類, 海水中的不揮發(fā)烴類, 使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。
高效液相色譜儀常見(jiàn)故障處理
L C - 10A T 高效液相色譜儀是日本島津公司1996 年的產(chǎn)品, 檢測(cè)器為可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器, 色譜柱為島津公司的ODS - C18 ,大連依利特的ODS -C18 。
八年的日常工作中遇到了幾種故障,如故障1 經(jīng)咨詢島津公司的工程師后,得以解決;故障2、故障5 是頻繁碰到的問(wèn)題等,特作總結(jié)如下:
故障1
流動(dòng)相內(nèi)有氣泡, 關(guān)閉泵, 打開(kāi)泄壓閥, 打開(kāi)p urge鍵, 清洗脫氣, 氣泡不斷從過(guò)濾器冒出, 進(jìn)入流動(dòng)相, 無(wú)論打開(kāi)p urge 鍵幾次,都無(wú)法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。
原因過(guò)濾器長(zhǎng)期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi), 過(guò)濾器內(nèi)部由于霉菌的生長(zhǎng)繁殖,形成菌團(tuán),阻塞了過(guò)濾器,緩沖液難以流暢地通過(guò)過(guò)濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過(guò)濾器進(jìn)入流動(dòng)相。
處理過(guò)濾器浸泡于5 %硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過(guò)濾器浸泡于5 %硝酸溶液中12～36 小時(shí), 輕輕震蕩幾次, 再將過(guò)濾器用純水清洗幾次, 打開(kāi)泄壓閥, 打開(kāi)p urge 鍵,清洗脫氣, 如仍有氣泡不斷從過(guò)濾器冒出, 繼續(xù)將過(guò)濾器浸泡于5 %硝酸溶液中,如沒(méi)有氣泡不斷從過(guò)濾器中冒出,說(shuō)明過(guò)濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞, 流動(dòng)相可以流暢地通過(guò)過(guò)濾器。打開(kāi)泄壓閥,打開(kāi)泵,流速調(diào)至1. 0～3. 0ml/ min ,純水沖洗過(guò)濾器1 小時(shí)左右。即可將過(guò)濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時(shí)即可。
故障2
柱壓高原因(1) 緩沖液鹽分如(乙酸銨等) 沉積于柱內(nèi); (2) 樣品污染沉積。
處理對(duì)于第一種情況先用40～50 ℃的純水,低速正向沖洗柱子, 待柱壓逐漸下降后, 相應(yīng)提高流速?zèng)_洗, 柱壓大幅度下降后, 用常溫純水沖洗, 之后用純甲醇沖洗柱子30 分鐘; 對(duì)于第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子, 然后換成甲醇沖洗, 接著用甲醇+ 異丙醇(4 + 6) 沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定) , 再用換成甲醇沖洗, 然后用純水沖洗, 最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30 分鐘以上。
故障3
既無(wú)壓力指示,又無(wú)液體流過(guò)[1 >。
原因(1) 泵密封墊圈磨損; (2) 大量氣泡進(jìn)入泵體。
處理對(duì)于第一種情況,更換密封墊圈;對(duì)于第二種情況,在泵作用的同時(shí), 用一個(gè)ml 的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。
故障4
壓力波動(dòng)大,流量不穩(wěn)定.
原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。
處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量, 保證不銹鋼濾器沉入儲(chǔ)液器瓶底,避免吸入空氣,流動(dòng)相要充分脫氣[2 >。如為單向閥和閥座之間夾有異物, 拆下單向閥, 放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗.
故障5
出峰不佳,峰分叉。
原因(1) 色譜柱被污染; (2) 柱頭填料塌陷。
處理對(duì)于第一種情況, 先用純水反向沖洗柱子, 然后換成甲醇沖洗, 接著用甲醇+ 異丙醇(4 + 6) 沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定) , 再換成甲醇沖洗, 然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30 分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對(duì)于第二種情況,擰開(kāi)柱頭,檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料) ,裝入新填料, 滴一滴甲醇, 填料下陷, 再填, 用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊, 再填平, 滴甲醇, 再壓緊反復(fù)幾次, 直至裝滿填平[2 >。柱頭用甲醇沖洗干凈, 擦凈柱外壁的填料, 擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30 分鐘以上。
故障6
峰面積重復(fù)性不佳。
原因(1) 進(jìn)樣閥漏液; (2) 加樣針不到位。
處理對(duì)于第一種情況更換進(jìn)樣閥墊圈; 對(duì)于第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD 狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJ EC T 狀態(tài),以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常工作中, 液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要, 如要注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中, 儲(chǔ)液器內(nèi)的溶液如長(zhǎng)時(shí)間未用應(yīng)清洗儲(chǔ)液器并更換溶液, 每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無(wú)機(jī)鹽析出或沉積; 樣品的前處理也很重要,任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì), 完全溶解, 盡量減少對(duì)色譜柱的污染, 以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命, 同時(shí)避免注射過(guò)濃的樣品溶液, 以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞; 色譜柱作好標(biāo)記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
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