臨床生物化學/酶活性測定條件的選擇和限定

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臨床生物化學

血清酶定量的檢測技術
- 酶活性測定的常用技術和方法
- 酶活性測定條件的選擇和限定
- 測定酶活性濃度的兩大類方法

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引言中已強調了僅在一定條件下酶反應速度v才和酶量成正比例。一定條件是什么？這些條件之間有無主次關系？如何選擇合適的測定條件？這些都是實驗室工作者在設計或選擇測酶活性濃度方法時必須面對的問題。

首先可從理論上探討在什么特定情況下的反應速度才可能與酶量成正比例。酶的整個反應過程可簡化如下：

式中Kp可看成為ES的解離常數.Michaclis和Menten通過推導可得出下式方程式

此式中V為最大反應速度，對一定濃度的酶而言為一常數。Km為實驗室工作所熟系的米氏常數。上式也可改寫為：

Kp和Km雖為常數，但［S］為變量，因此

在一般情況下不可能為常數，即v≠k［E］，從理論上很清楚說明反應速度v和酶量E之間在絕大多數條件下只存正比，即v∝［E］。而非正比例關系。但在底物［S］濃度很大，遠遠超過Km的特殊條件下Km值由于相對很小可忽略不計。此式可變為：

由于底物［S］濃度很大，使酶飽和。ES已達極限，反應速度不再增加，故此時反應速度為最大反應V。即從理論上說只有測定的是酶最大反應V。此時反應速度才和酶量E成正比例。也只有在此基礎上建立起來的測定方法才是可靠的、準確的。

Kp是酶學中很重要的一個常數，即周轉數（Turnover number），從上式可得出。

其含義為每分鐘每分子酶轉換底物分子數。酶的Kp數值約在50-105min^-1之間。碳酸酐酶是目前已知最高酶變率的酶（36×10^-6min^-1）。Kp的倒數代表每一酶催化循環的時間，以碳酸酐酶為例

1/Kp=lmin/136×106＝0.028×10^－6min＝1.7μs

即每隔1.7μs，一分子酶就和一個底物結合，反應一次。

國際臨床化學聯合會（IFCC）和不少國家包括我國的一些學會建立了或正在建立測定酶活性濃度的推薦或參考方法。都毫無例外地提出測酶活性濃度方法所選擇的測定條件應是酶反應的“最適條件”以保證酶具有最大的催化活性。實質上就是基于以上理論考慮，要測定酶的最大反應速度V。

我國檢驗學會文件中對最適條件是這樣提出：①選合適的底物、輔因子、活化劑、變構劑的種類和濃度。②指示酶和輔助酶的種類和濃度。③反應混合液的最適pH，緩沖液種類和濃度。④其它影響酶活性的因素，如去除各種抑制劑。并提出：在某些情況下，為了獲得更好的測定重復性或更大的臨床價值，可考慮對上述“最適條件”作適度的修改。