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臨床生物化學(xué)

血清酶定量的檢測(cè)技術(shù) 酶活性測(cè)定條件的選擇和限定 底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類和濃度 指示酶與輔助酶的種類和濃度 反應(yīng)體系的最適pH、緩沖液的種類和濃度 其它影響酶活性因素 溫度的控制

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這一項(xiàng)包括幾種因子，其中最重要的是底物種類和濃度，這是每種測(cè)酶活性濃度方法中首先需要選擇的項(xiàng)目，選擇恰當(dāng)與否，對(duì)該酶測(cè)定至關(guān)重要。后面幾項(xiàng)則不是每種酶測(cè)定都會(huì)遇到的選擇。

（一）選合適的底物種類和濃度

如所測(cè)的酶專一性不強(qiáng)，可作用于多種底物，首先就需決定選擇哪一類底物作為測(cè)此酶的底物。如該項(xiàng)酶測(cè)定主要用于臨床診療工作，則首先應(yīng)考慮選有較高診斷價(jià)值的底物。例如臨床上測(cè)定酸性磷酸酶主要用于診斷前列腺癌，所選的底物應(yīng)對(duì)前列腺酸性磷酸酶有較高的特異性。不易被其它組織如紅細(xì)胞、血小板中酸性磷酸酶所作用，在常用的底物中以麝香草酚磷酸鹽最符合上述選擇條件。但如進(jìn)行酶基礎(chǔ)研究，探討其在體內(nèi)作用時(shí)，則選擇酶在體內(nèi)的生理底物更為合適，一般而言在多種底物中，Km最小的底物往往是此酶的生理底物。

選擇Km小的底物測(cè)定酶還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是在最大反應(yīng)速度V的底物濃度也將最低。在實(shí)際工作中可能意味著試劑成本可能較低，不易出現(xiàn)底物難溶解的困難。

底物專一性強(qiáng)的酶雖然不面臨上述選擇，但只要所測(cè)酶催化的是可逆反應(yīng)，則和專一性不強(qiáng)酶一樣，都面臨著是選擇正向還是逆向反應(yīng)來(lái)測(cè)定酶，不同反應(yīng)方向的底物必然是不一樣的。這方面的選擇更多從技術(shù)和實(shí)用方面加以考慮往往選擇速度較快的方向，因?yàn)檫@可以提高測(cè)定的靈敏度，如測(cè)定肌酸激酶（CK），由于磷酸肌酸價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定，早期多選用正向反應(yīng)，底物為肌酸和ATP速度太慢，只是逆向反應(yīng)的1/6，測(cè)定靈敏度太低，以致正常標(biāo)本結(jié)果誤差很大。近年來(lái)都改用逆向反應(yīng)測(cè)定CK，明顯提高CK測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度。在此問(wèn)題上，實(shí)用考慮也起了不小作用。例如測(cè)定乳酸脫氫酶（LD）時(shí)，如考慮到正向反應(yīng)明顯快于逆向反應(yīng)，則應(yīng)考慮以丙酮酸和NADH為底物，這正是IFCC和其它一些學(xué)會(huì)推薦的方法。但目前市售的測(cè)LD的試劑盒不少都以乳酸和NAD＋為底物。因?yàn)镹AD＋價(jià)格明顯低于NADH，并且穩(wěn)定可長(zhǎng)期儲(chǔ)存。科研工作中如需測(cè)LD，還是最好采用IFCC的方法。

確定底物種類后，重要的問(wèn)題是選擇底物的合適濃度，在討論此問(wèn)題之前，有必要先簡(jiǎn)單復(fù)習(xí)一下底物濃度和酶反應(yīng)速度之間的關(guān)系，因其不同于其它化學(xué)反應(yīng)有其獨(dú)特之處，圖17-2很形象表示出這種差異。

反應(yīng)物濃度［S］

圖17-2a 反應(yīng)物濃度對(duì)化學(xué)反應(yīng)的影響

底物濃度［S］

圖17-2b　底物濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響

圖a表示在一般化學(xué)反應(yīng)中遵循質(zhì)量作用定律，反應(yīng)速度隨反應(yīng)物質(zhì)濃度增加成正比例增加，圖b則表示酶反應(yīng)中底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，酶反應(yīng)速度幾乎隨底物增加成正比例加快，進(jìn)一步升高底物濃度，雖然反應(yīng)速度也加快，但增加速度愈來(lái)愈慢，不成比例。到一定程度，反應(yīng)速度趨于恒定為一常數(shù)，實(shí)際上就是趨向最大反應(yīng)速度V，測(cè)定此處的反應(yīng)速度V，最能準(zhǔn)確地反映酶量多少。在此處底物濃度變化，對(duì)反應(yīng)速度影響很小。

Michaclis和Menten二式首先在本世紀(jì)初對(duì)酶反應(yīng)的此項(xiàng)獨(dú)特現(xiàn)象從理論上加以合理解釋。并推導(dǎo)出著名的米-門方程式：

此公式對(duì)選擇酶測(cè)定的底物濃度有重要的指導(dǎo)作用。Km對(duì)每一種酶而言在一定條件下為一常數(shù)，并可從上述方程式求出，在反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度V一半時(shí)，代入上式得：

Vkm＋V［S］＝2V［S］

VKm＝V［S］

［S］＝Km

換言之，當(dāng)酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)，此時(shí)的底物就相當(dāng)于酶的米氏常數(shù)Km。以mol/L表示之，大多數(shù)酶Km在10^-3至10^-5mol/L之間。

當(dāng)我們知道或計(jì)算出某一酶的Km后就可以計(jì)算出不同底物濃度和Km間的比值，化入米-門方程式就可計(jì)算出此時(shí)酶促反應(yīng)速度相當(dāng)于最大反應(yīng)速度的百分比，見(jiàn)表：17-3

表17-3　底物濃度與Km比值相當(dāng)?shù)淖畲蠓磻?yīng)百分比

［S］/Km	V/V×100
100.0	99.0
10.0	91.0
1.0	50.0
0.1	9.0
0.01	0.99

依據(jù)上表一般都認(rèn)為酶測(cè)定時(shí)底物濃度最好為Km的20倍乃至100倍。在實(shí)際工作考慮到底物溶解度的限制，價(jià)格的昂貴，可將底物濃度降為Km的10倍。再低就不適合酶的測(cè)定，可能產(chǎn)生較大誤差。

以上規(guī)律適用于大多數(shù)酶。一些酶還有其特殊情況，常能遇到的是當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǚ秶螅阜磻?yīng)速度不僅不增加，反而下降。如乳酸脫氫酶，當(dāng)丙酮酸濃度超過(guò)一定量時(shí)，酶活性反而下降，故丙酮酸濃度不能過(guò)高。

以上介紹的米-門方程式只適用于單一底物的酶，不少酶催化反應(yīng)二底物乃至更多底物，有關(guān)二底物的米-門方程以及此時(shí)底物濃度的選擇可參考一些有關(guān)書(shū)籍。實(shí)際工作中最簡(jiǎn)單的作法是先將其中底物之一的濃度選得很高，使酶飽和，然后求出另一底物的表觀Km，反之亦然，最后按上述規(guī)律決定二底物的合適濃度。

（二）輔因子、活化劑的種類和濃度

從廣義上說(shuō)，凡能促進(jìn)酶及反應(yīng)物進(jìn)入活化狀態(tài)從而加速酶催化反應(yīng)的物質(zhì)都能稱為輔因子，它包括種類很廣的物質(zhì)。英漢生化詞典將輔因子（cofactors）定義為“一種酶的活性所需要的一種非蛋白質(zhì)成分”。這種輔因子可能是一種金屬離子激活劑或一種有機(jī)分子（輔酶）。它們或松或緊地與酶相結(jié)合；緊密接合的輔因子稱為“輔基”。將激活劑（activator）定義為“一種金屬離子，作為一種酶的輔助因子。”

在前面已談到，測(cè)酶活性濃度時(shí)應(yīng)該在最適條件下測(cè)酶反應(yīng)的最大速度。如測(cè)定酶需要輔因子，活化劑時(shí)，應(yīng)選擇合適的種類和濃度加入到測(cè)定酶的體系中，在些過(guò)程中可能會(huì)涉及到下列四類物質(zhì)。

首先是輔酶（Coenzyme）。很多酶反應(yīng)都必須有輔酶參加。如相當(dāng)部分的還原酶需要輔酶Ⅰ（NAD＋）和輔酶Ⅱ（NADD＋）參加。ATP是激酶（Kinase）反應(yīng)中不可少的輔酶，這類物質(zhì)一般是小的有機(jī)化合物，和輔基不同點(diǎn)是與酶蛋白結(jié)合很松弛，用透析和其它方法很易將它們與酶分開(kāi)，盡管它們不用于酶的底物，特異性不強(qiáng)，往往參加一系列酶反應(yīng)和代謝過(guò)程。但在作用方式上和底物類似，在酶反應(yīng)過(guò)程中與酶結(jié)合、分離及反復(fù)循環(huán)。在方法學(xué)上，可將它們按底物處理，即可按米-門方程式求出其Km，按底物規(guī)律選擇其濃度。

第二是輔基，輔基雖也是小的有機(jī)化合物，但卻是酶蛋白不可分割部分，不含輔基的酶蛋白稱為脫輔基酶蛋白（apoenzyme），沒(méi)有催化活性，必須加入足量輔基，和它結(jié)合成為全酶（holoenzyme），才可能有催化活性。最典型的例子是各種轉(zhuǎn)氨酶需要磷酸吡哆醛為其輔基，在反應(yīng)過(guò)程中。氨基酸將其氨基交給吡哆醛變?yōu)檫炼甙罚旧斫邮苋┗蔀?a href="/w/%E9%85%AE%E9%85%B8" title="酮酸">酮酸，然后吡哆胺將氨基轉(zhuǎn)交給酮酸生成氨基酸，本身又變回吡哆醛。從此機(jī)制不難理解為何脫輔基酶蛋白無(wú)催化活性。

輔基和輔酶不同點(diǎn)不僅表現(xiàn)在和酶蛋白結(jié)合緊密，不易為透析所除去，和酶作用方式也不同，不似輔酶迅速與酶結(jié)合，又迅速分解為酶和產(chǎn)物，輔基顯著特點(diǎn)之一是與酶結(jié)合需要一定時(shí)間，因此在酶測(cè)定時(shí)，如按底物一樣來(lái)處理輔基，在酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)才加入輔基，則開(kāi)始階段反應(yīng)較慢，經(jīng)過(guò)一段延滯期后，反應(yīng)才達(dá)到應(yīng)有速度。因此在酶測(cè)定時(shí)，往往是先加入足量輔基，作用一定時(shí)間如10分鐘后，再加入底物開(kāi)始酶反應(yīng)。

很多輔酶和輔基來(lái)自維生素或結(jié)構(gòu)中含有維生素，如NAD和NADP來(lái)自維生素尼克酸，轉(zhuǎn)氨酶的輔基磷酸吡哆醛來(lái)自維生素B₆（吡哆醇）。來(lái)自維生素B₁的焦磷酸硫胺素是丙酮酸脫羧反應(yīng)的輔羧化酶。從維生素B₂（核黃素）形成的FAD，F(xiàn)MN是很多呼吸鏈上酶的輔基，維生素H（生物素）在羧化和脫羧作用中起輔基作用，葉酸衍生物參與一碳基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。維生素B₁₂的衍生物鈷胺酰胺參與酶催化的異構(gòu)反應(yīng)。

第三類物質(zhì)是離子，很多酶需要特定離子幫助才能使其反應(yīng)達(dá)到最大速度。最常見(jiàn)的是二價(jià)金屬離子如Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺等。所有轉(zhuǎn)移磷酸的酶，如激酶類和堿性磷酸酶的反應(yīng)都需要Mg²⁺的參加。所以如在反應(yīng)體系中加入金屬螯合劑如ED-TA或以他們?yōu)榭鼓齽┏Ｒ种埔恍┟傅幕钚浴Ｒ虼嗣笢y(cè)定的標(biāo)本多采用血清而不采用血漿，以外還有單價(jià)的K⁺。如丙酮酸激酶反應(yīng)同時(shí)需要K⁺和Mg²⁺。淀粉酶催化的反應(yīng)需要陰離子Cl^-，5mmol/L氯離子可加速淀粉酶的反應(yīng)三倍。

離子加速酶反應(yīng)的機(jī)制是多種多樣，Zn²⁺是堿性磷酸酶和羧基肽酶A整體結(jié)構(gòu)的一部分，可穩(wěn)定酶的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。Cl^-加速淀粉酶反應(yīng)的機(jī)制可能與它能與酶分子中某些帶陽(yáng)電荷基團(tuán)結(jié)合有關(guān)，改變了在催化作用中起重要作用的基團(tuán)的電離常數(shù)，有些離子可使酶分子帶陽(yáng)電荷，和帶陰性電荷的底物結(jié)合，在酶反應(yīng)中起了橋梁作用。必須注意的是，過(guò)量的離子往往抑制酶反應(yīng)速度，在測(cè)定酶時(shí)要選擇合適的濃度。

第四類是一些無(wú)法包括在前三類的其它加速酶反應(yīng)物質(zhì)，如巰基化合物可穩(wěn)定酶的雙硫鍵。在肌酸激酶反應(yīng)體系中加入它將明顯增高酶活性，并且隨所加巰基化合物的不同，增加的速度也有差異，所以在測(cè)肌酸激酶時(shí)要選擇好巰基化合物的種類與合適的濃度。

還有所謂的表觀激活作用，該物質(zhì)并不是真正加快反應(yīng)速度，而是由于和抑制劑作用抵消了抑制作用，從表面上看似乎是加速了酶的反應(yīng)作用。

（三）選變構(gòu)劑的種類與濃度

有一類特殊的酶叫變構(gòu)酶（allosteric enzyme），其反應(yīng)速度和底物關(guān)系不同于一般酶的雙曲線，而出現(xiàn)S形曲線，這是由于這種酶具有二個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特的部位－或是相互作用的催化部位，或是相互作用的催化部位與調(diào)節(jié)部位，其結(jié)果是酶與底物作用速度將受另一類物質(zhì)的影響，這類物質(zhì)命名為變構(gòu)劑或效應(yīng)物。根據(jù)作用不同又分為變構(gòu)激活劑和變構(gòu)抑制劑或者正負(fù)效應(yīng)物，而不同濃度的變構(gòu)劑會(huì)明顯改變曲線形狀。變構(gòu)酶在物質(zhì)代謝中有重要的調(diào)節(jié)作用。在測(cè)定變構(gòu)酶活性濃度時(shí)，必須選擇好變構(gòu)劑種類和濃度。一般來(lái)說(shuō)應(yīng)選擇在飽和濃度的變構(gòu)劑的條件下測(cè)定構(gòu)酶的活性濃度。

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