基礎檢驗學/脫落細胞標本采集和涂片制作方法
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一、標本采集
正確地采集標本是細胞學診斷的基礎和關鍵之一，故要準確地選擇部位，盡可能在病變區直接采集細胞。采集的標本必須保持新鮮，盡快制得，以免細胞自溶或腐敗。盡可能避免血液、粘液等混入標本內，采集方法應簡便，操作輕柔，避免病人痛苦和引起嚴重并發癥及促進腫瘤擴散，下面介紿幾種常用的標本采集方法。
（一）直視采集法
外陰、陰道、陰道穹窿、宮頸、口腔、肛管、鼻腔、鼻咽部、眼結膜及皮膚等部位，可以直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗、食管、胃、直腸、氣管和肺內支氣管則使用纖維內鏡在病灶處直接刷取細胞制片。
（二）自然分泌液的采集法
1．痰液涂片檢查：痰興高采烈為支氣管等呼吸的分泌物，對支氣管肺癌和其它呼吸道疾病細胞學診斷具有重要價值。
2．尿液涂片檢查：收集尿液中脫落的泌尿道細胞成分，作泌尿道腫瘤和某些疾病的細胞學診斷。
4．前列腺液涂片檢查：采用前列腺按摩法取得分泌物，作前列腺細胞學診斷。
（三）灌洗洗
向空腔器官或腹腔、盆腔（剖腹探查時）灌注一定量生理鹽水沖洗，使其細胞成分脫落于液體中，收集灌洗液離心制片，作細胞學檢查。
（四）磨擦法
利用磨擦工具在病變部位磨擦，將擦取物直接涂片。常用磨擦工具有海棉磨擦器、線網套、氣囊等。可分別用于鼻咽部、食管和胃部病灶的取材。
（五）針穿抽吸法
當有胸腔、腹腔、心包腔及關節腔積液時，可用針穿抽吸部分積液作細胞學檢查。此外某些深部組織器官，如淋巴結、甲狀腺、軟組織、肝等亦可作細針穿刺吸取部分細胞進行涂片診斷。
二、涂片制作方法
（一）涂片前準備工作及涂片方法
1．涂片前準備工作
（1）保證標本新鮮，取材后盡快制片。
（2）涂操作要輕巧，避免擠壓以防止損傷細胞。涂片要均勻，厚薄要適度，太厚細胞堆疊，太薄細胞過少，均影響診斷。
（3）玻片要清潔無油漬，先用硫酸洗滌液浸泡沖洗，再用75%乙酸浸泡。
（4）含蛋白質的標本可直接涂片，缺乏蛋白質的標本，涂片前先在玻片上涂薄層粘附劑，以防止染色時細胞脫落，常用粘附劑為蛋白甘油，由等量生雞蛋白和甘油混合而成。
（5）每位患者的標本至少涂兩張玻片，以避免漏診。涂片后立即在玻片一端標上編號。
2．涂片制備方法
（1）推片法：用于稀薄的標本，如血液，胸、腹水等。取離心后標本一小滴滴在玻片偏右側端，用推片用30度夾角將玻片上檢液輕輕向左推。
（2）涂抹法：適用于稍稠的檢液，如鼻咽部標本。用竹棉簽在玻片上涂布，由玻片中心經順時針方向外轉圈淫抹；或從玻片一端開始平行涂抹，涂抹要均勻，不宜重復。
（3）壓拉涂片法：將標本夾于橫豎交叉的兩張玻片之間，然后移動兩張玻片，使之重疊，再邊壓邊拉，獲得兩張涂片。該法適用于較粘稠標本，如痰液。
（4）吸管推片法：用吸和將標本滴在玻片一端，然后將滴管前端平行置于標本滴上，平行向另一端均速移動滴管即可推出均勻薄膜。此法亦適用于胸、腹水標本。
（5）噴射法：用配細針頭的注射器將標本從左至右反復均勻地噴射在玻片上，此法適用于各種吸取的液體標本。
（6）印片法：將切取的病變組織用手術切開，立即將切面平放在玻片上，輕輕按印。此方法為活體組織檢查的輔助方法。
（二）涂片的固定
固定（fication）的目的是保持細胞自然形態，防止細胞自溶和細菌所致的腐??；固定液能沉淀和凝固細胞內蛋白質和破下細胞內溶酶體酶，使細胞不但保持自然形態，而且結構清晰，易于著色。因此標本愈新鮮，固定愈及時，細胞結構愈清晰，染色效果愈好。
1．固定液：細胞學檢查常用的固定液有下列三種：第一種乙醚酒清固定液：該固定液滲透明性較強，固定效果好適用于于一般細胞學常規染色；二種是氯仿酒精固定液：又稱卡諾氏固定液。其優點同上；第三種95%酒精固定液：適用于大規模防癌普查。制備簡單。但滲透作用稍差。
2．固定方法
（1）帶濕固定：涂片后未待標本干燥即行固定的方法稱帶濕因定。此法因定細胞結構清楚，染色新鮮。適用于巴氏或HE染色。痰液、陰道分泌物及食管拉網涂片等常任常用此方法。
（2）干燥因定：涂片后未待其自然干燥，再行固定。適用于稀薄標本如尿液、胃沖洗液等，也適用于于瑞特染色和姬姆薩染色。
3．固定時間：一般為15-30min。含粘液較多標本，如痰液、陰道分泌物、食管拉網等因定時間在適當延長；尿液、胸、腹水等涂片不含粘液，固定時間可酌情縮短。
（三）涂片的染色
1．染色的目的和原理：染色的日的是借助于一種或多種染料，使組織和細胞內結構分別著不同的染色，這樣在顯微鏡下能清楚地觀察細胞內部結構，作出正確判斷。
組織細胞染色原理至今尚無滿意的解釋，可能是物理作用，也可能是化學作用，或者是兩者綜合作用的結 果。
染色的物理作用是利用毛細管現象，滲透、吸收和吸附作用，使染料的色素顆粒牢固地進入組織細胞，并使其顯色。
染色的化學作用是滲入組織細胞的染料與其相應的物質起化學反應，產生有色的化合物。
各染料都具有兩種性質，即產生顏色；征收被組織形成親和力。這兩種性質主要由發色基因和助色基因所產生的。
發色基團：苯的衍生物具有可見光區吸收帶。這些衍生物顯不的吸收帶與其價鍵的不穩定性有關，如對苯二酚為無色，當其氧化后失去兩個氫原子，它的分子或則變為有黃色的對醌，這種產生顏色的醌式環稱為發色基團。若一種化合物含有幾個環，只要其中有一個醌式環就會發出顏色，稱此發色基團為色原（chromogen）.
助色基團：是一種能使化合物以生電離作用的輔助原子團（酸堿性基團）。它能使染色的色澤進一步加深，并使其與被染色組織具有親和力。
助色基團的性質決定染料是酸性堿性。堿性染料具有堿性助色基團，在溶媒中產生的帶色部分為帶正電荷的陽離子，吻與組織細胞內帶負電荷的物質結合而顯色。如細胞核內的主要化學成分脫氧化核糖核酸易被蘇木素染成紫藍色，稱嗜堿性。酸性染料具有酸性用力色基團，在溶酶中產生帶色部分為陰離子，易與組織細胞內帶正電荷部分結合而顯色，此性質被稱為嗜酸性，如細胞漿內訂成分為蛋白質，易與伊紅或橘黃結合呈紅色或橘黃色。
2．常用染色方法：臨床日常工作中較為常用的染色方法有下列3種：
（1）巴氏染色法：本法染色特點是細胞具有多色性顏色，色彩鮮艷多彩。涂片染色的透明性好，胞質顆粒分明，胞核結構清晰，如鱗狀上皮過度角化細胞胞質呈橘黃色；角化細胞顯粉紅色；而角化前細胞顯淺綠色或淺藍色，適用于上皮細胞染色或觀察陰道涂片中激素水平對上皮細胞的影響。此方法的缺點是染色程序比較復雜。
（2）蘇木精—伊紅（hemotoxylin eosin,HE）染色法：該方法染色透明度好，核與胞質對比鮮明。染色步驟簡便，效果穩定。適用于痰液涂片，觖質核呈紫藍色，胞質淡玫瑰紅色，紅細胞呈淡朱紅色。
（3）瑞特—吉姆薩染色法（wrightgiemsa atain）；本方法多用于血液，骨髓細胞學檢查。胞質內顆粒與核安危質結構顯示較清晰。操作簡便。
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