生物化學與分子生物學/DNA復制的方式及一般過程

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生物化學與分子生物學

DNA的生物合成
- DNA的復制
  - DNA復制的方式及一般過程
  - DNA復制的起始階段：
  - DNA復制的延長階段以及參與的酶和蛋白質分子
  - DNA復制的終止階段
  - 真核生物DNA復制的特點

(一)DNA的半保留復制(semiconservative replication)

Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結構模型時即推測，DNA在復制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈是新合成的，這種復制方式為半保留復制。

1958年Meselson和Stahl利用氮標記技術在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留復制，他們將大腸桿菌放在含有15N標記的NH4Cl培養基中繁殖了15代，使所有的大腸桿菌DNA被15N所標記，可以得到15N桪NA。然后將細菌轉移到含有14N標記的NH4Cl培養基中進行培養，在培養不同代數時，收集細菌，裂介細胞，用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法觀察DNA所處的位置。由于15N桪NA的密度比普通DNA(14N-DNA)的密度大，在氯化銫密度梯度離心(density gradientcentrifugation)時，兩種密度不同的DNA分布在不同的區帶。

實驗結果表明：在全部由15N標記的培養基中得到的15N桪NA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。當轉入14N標記的培養基中繁殖后第一代，得到了一條中密度帶，這是15N桪NA和14N-DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個區帶，這表明它們分別為15N14N-DNA和14N14N-DNA。隨著以后在14N培養基中培養代數的增加，低密度帶增強，而中密度帶逐漸減弱，離心結束后，從管底到管口，CsCl溶液密度分布從高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在與其相當的CsCl密度處，在紫外光下可以看到DNA分子形成的區帶。為了證實第一代雜交分子確實是一半15N-DNA－半14N-DNA，將這種雜交分子經加熱變性，對于變性前后的DNA分別進行CsCl密度梯度離心，結果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區帶，即重密度帶(15N-DNA)及低密度帶(14N-DNA)。它們的實驗只有用半保留復制的理論才能得到圓滿的解釋(圖16－2和16-3)。


圖16-2　DNA的半保留復制第一代分子含有一條親代的鏈(用黑色素示)，與另一條新合成的鏈(用白色表示)配對。在以后的連續復制過程中，原來親代的兩條鏈仍然保持完整，因此總有兩個分子各具有一條原來親代的鏈。	圖16-3　DNA的半保留復制－MeslsonStahl實驗密度梯度離心后的DNA位置：左三管為對照；右三管為實驗結果

(二)DNA復制的一般過程：

DNA雙螺旋是由兩條方向相反的單鏈組成，復制開始時，雙鏈打開，形成一個復制叉(replicative fork,從打開的起點向一個方向形成)或一個復制泡(replicative bubble，從打開的起點向兩個方向形成。)兩條單鏈分別做模板。各自合成一條新的DNA鏈。由于DNA一條鏈的走向是5′→3′方向，另一條鏈的走向是3′→5′方向，但生物體內DNA聚合酶只能催化DNA從5′→3′的方向合成。那么，兩條方向不同的鏈怎樣才能做模板呢?這個問題由日本學者崗崎先生解決。

原來，在以3′→5′方向的母鏈為模板時，復制合成出一條5′→3′方向的前導鏈(leadingstrand)，前導鏈的前進方向與復制叉打開方向是一致的，因此前導鏈的合成是連續進行的，而另一條母鏈DNA是5′→3′方向，它作為模板時，復制合成許多條5′→3′方向的短鏈，叫做隨從鏈(lagging strand)，隨從鏈的前進方向是與復制叉的打開方向相反的。隨從鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做崗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物崗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般100?00核苷酸。最后再將多個崗崎片段連接成一條完整的鏈。由于前導鏈的合成是連續進行的，而隨從鏈的合成是不連續進行的，所以從總體上看DNA的復制是半不連續復制(圖16-4)。

DNA的半不連續復制

圖16－4　DNA的半不連續復制

DNA復制的全部過程可以人為地分成三個階段，第一個階段為DNA復制的起始階段，這個階段包括起始點，復制方向以及引發體的形成，第二階段為DNA鏈的延長，包括前導鏈及隨從鏈的形成和切除RNA 引物后填補空缺及連接崗崎片段。第三階段為DNA復制的終止階段。在DNA復制的整個過程中需要30多種酶及蛋白質分子參加，我們將在DNA復制的各個階段中著重介紹它們的作用。