臨床生物化學/核酸雜交技術

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臨床生物化學

診斷分子生物學基本技術
- 分子生物學實驗診斷技術
  - 核酸雜交技術
  - 核酸擴增技術
  - 核酸限制性片段長度多態性（RFLP）分析
  - 核酸一級結構（核苷酸序列sequence）分析

檢驗方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復雜的物體中，使無法感覺的特定物質進入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測技術就是利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結構與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實驗室用得多，臨床實驗室用得較少，除成本高外，關鍵是操作復雜，重復性差，僅能半定量。成本高可隨經濟發展而緩和，但其它缺點尚需努力克服。

雜交實驗的探針應具有特異性，對應不同的雜交方法靶基因（被檢基因）應有一定的純度與豐度。雜交反應的開始是碰撞，探針濃度高則速率增加，一般³²P標記探記探針5-100ng/ml，非放射性探針25-1000ng/ml，原位雜交無論放射還是非放射物標記，一般都需0.1-5.0μg/ml。當探針過量時，雜交速率取決于探針長度，如一個100ng/ml20個核苷酸的合成寡核苷酸探針與1-100pg 1kb長的靶基因雜交，10分鐘能達到最大雜交率。而相同條件下2kb的克隆探針需160小時。主要原因是這里所指濃度是重量濃度而非摩爾濃度。長探針因標記量大，小的摩爾濃度已足以達到需要的檢測靈敏度。為了促進長探針（＞250個核苷酸）的雜交速率，加入雜交促進劑是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用濃度為5％-10％，濃度過高會增加雜交液粘度。聚乙二醇也作為促進劑，價廉且粘度低，但檢測本底太高。另外雜交的溫度、鹽濃度、甲酰胺濃度可調節雜交分子形成的穩定性。理論選用DNA：DNA雜交溫度T＝Tm－25℃，此時雜交分子最易形成。但具體實驗中影響Tm值的因素很多，一般雜交溫度低，形成的雜交分子較穩定。RNA：DNA雜交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA雜交分子的Tm大20-25℃，使得雜交溫度提高，此時需調節甲酰胺濃度來調節雜交溫度。好的實驗條件最終應在實踐中摸索建立。

（一）斑點雜交

將少量核酸樣品點樣在硝酸纖維素濾膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探針進行雜交。尼龍膜，特別是聚偏氟乙烯膜（PVDF）與DNA結合力更高，堅韌、易操作。點樣可手工，也可用真空點樣品。檢測可用放射性探針自顯影或非放射性探針顯色。可用于DNA或RNA分析。下面以非放射性探針分析DNA為例，結果是顯色。

取硝酸纖維素膜和濾紙在2xSSC(NaCl 300mmol/L，檸檬酸鈉30mmol/L)，pH7.0浸15分鐘，平鋪濾紙在點樣抽濾器上，再鋪上硝酸纖維濾膜，真空抽氣使點樣器減壓，膜顯出凹面。點樣50μl（5-10μgDNA，可直接點血清樣品）于凹面，撤去真空，把膜晾干。取濾紙浸0.5mol/l NaOH，1.0mol/l NaCl，把膜平鋪于濾紙上20分鐘，變性。取濾紙二張分別浸在0.5mol/l Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/l Tris-HCl，0.6mol/l NaCl pH7.5，分別依次把膜平鋪于濾紙上，各中和15分鐘，中和后膜的pH為7.2-7.5。于80℃，30-45分鐘烘干。（RNA分析點樣緩沖液系統不同，無需變性，中和，余大致相同）用塑料封口機把膜和2.5ml預雜交緩沖液封入塑料袋中，42℃，水浴30分鐘。

預雜交緩沖液：	65℃6xSSC	（原液：20xSSPE）
	5xDenhardt	（50xDenhardt）
	0.5％SDS	（10％SDS）
	100μg/ml變性鮭精DNA片段	（1mg/ml）
	42℃增加50％甲酰胺	（原液），配成20ml.

50xDenhardt：5g聚蔗糖（Ficoll，400型，Parmacia），5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組份Ⅴ，Sigma）加水至500ml。過濾后－20℃保存。

探針2ml（50-100ng/2ml預雜交緩沖液）于100℃，10分鐘，馬上置冰浴5分鐘（變性）。加入袋封口。42℃水浴過夜。去雜交液（可回收）。以2xSSC，0.1％SDS15ml，50℃5分鐘洗二次。0.1SSC，0.1％SDS洗二次。封閉：另取袋封入膜和封閉液（蛋白質50mg/ml，100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/LNaCl）2.5ml，37℃，30分鐘。去封閉液（可回收）。100mmol/lTris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl ，15ml，5分鐘洗二次。親和反應：酶標抗體3ml（酶有堿性磷酸酶、過氧化物酶等，標記物有抗地高辛、生物素等，現以地高辛標堿性磷酸酶為例4μg/3ml 100mmol/L Tris-HCl，150mmol/l MgCl₂，10mg/ml牛血清白蛋白），封入袋中37℃，30分鐘。100mmol/l Tris-Hcl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl₂，pH9.5，10ml，1分鐘洗一次。取硝基四氮唑蘭（NBT）75mg/ml 70％二甲基甲酰胺25μl，4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl（底物）和100mmol/l Tris-HCl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl₂，pH9.56ml混勻，37℃，避光反應三小時，顯色。蒸餾水洗膜，晾干。觀察結果。

（二）Southern blot

1975年E.Southern發明了將DNA切開，電泳分離，再變性，印跡到硝酸纖維（Nc）濾膜上，用探針進行雜交，檢測DNA的方法。自顯影或顯色用于DNA分析。以³²P標記放射性探針為例，放射自顯影觀察結果。（圖18-6）。

Southernblot體系

圖18-6　Southernblot體系

前述分離、純化的DNA樣品5-10μg/100μlTE，加限制性內切酶3Unit/1μgDNA和內切酶相應緩沖液，在相應溫度保溫1-3小時（不同的酶所用的緩沖液和溫度不同），乙醇沉淀，15-20μl TE溶解DNA斷片。前述電泳條件，與DNA分子量標準品（Marker，Ladder）一起，3-4V/cm電泳（30V12-15小時）。在紫外光下觀察Marker充分分離，結束電泳。將膠放入0.5mol/l NaCl，0.5mol/L NaOH液體中30分鐘，使DNA變性。同時將膜用蒸餾水浸潤，在0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液體的方盤皿上，放上濾紙兩頭浸在液體中，依次放上凝膠、膜、濾紙、一尺厚的吸水紙，壓力1kg的重物。轉移（印跡，blot）過夜。翌日，把膜放在0.5mol/l Tris-HCl，pH7.0-7.5，1mol/L NaCl液中，中和膜上堿性變性液15-30分鐘。戴上手套，用手指壓在膜上來回充分洗膜。室溫干燥一小時。用塑料封口機，把膜和預雜交緩沖液封在塑料口袋中，注意驅除袋內汽泡。熱水浴過夜。探針變性后，加入袋中再封口。熱水浴過夜。

洗膜：	2xSSPE，0.5％SDS，總體積200ml，室溫30分鐘。
	0.4％xSSPE，0.5％SDS，總體積200ml，60℃，30分鐘。
	將膜包入塑料袋，在暗室貼在X光底片上。－70℃，自顯影1-2天。
	沖片顯影，觀察結果（背景不清晰可重新洗膜再顯影）。

（三）Northern blot

用于RNA分析，電泳條件與轉膜方法與Southern blot不同外，RNA不必變性與中和，電泳時加電醛防止RNA發夾結構形成。其它步驟相同。

為了防止RNase水解需分析的mRNA，盡可能將器皿在160-180℃干熱滅菌8小時以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）泡2小時，滅菌水淋洗干凈，100℃干烤15分鐘。不能干熱滅菌的試劑等，也可加1％DEPC處理12小時（但不能用于Tris）后，100℃。加熱15分鐘（或高壓滅菌15分鐘）以抑制、分解RNase。1.0g瓊脂糖，滅菌水80ml加熱溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，滅菌水至1000ml。樣品緩沖液，x50TAE20μl，50％去離子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混勻。約10-30μg/10μl純化的RNA樣品，加二倍（20μl）樣品緩沖液（可點樣一個凝膠孔lane）。60℃水浴15min，馬上置冰浴。加1/10電泳指示劑。點樣電泳，75-80V電泳4-5小時（指示劑泳動7～8cm），結束電泳。電泳期間正負極緩沖液要不斷交換（可用蠕動泵），以免pH改變。電泳結束，將凝膠放在紫外光下可觀察到人rRNA大亞基28S（5.1kb），小亞基18S(2.0kb)，記下大小亞基移動距離（或拍照），可作為被測mRNA分子量分析的參照物。凝膠在50mmol/l NaOH中變性30分鐘（低濃度堿，此步可省）。膜在10xSSPE中浸20分鐘。用10xSSPE轉移過夜（同Southern blot）。80℃1-2小時干燥。用探針雜交后，顯影或顯色。

（四）原位雜交（insituhybridization）

在保持細胞形狀條件下，進行細胞內雜交，顯影或顯色。用于DNA或RNA分析。

細胞用離心涂片機涂片或組織切片置于載玻片上。4％多聚甲醛（PFA）/PBS固定（固定時間因標本而異10-20分鐘，也可用含2％甲醛，0.05％戊二醛，2.5mmol/lCaCl₂的0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.3，500W微波爐中照射10-20秒，固定）。馬上用PBS洗標本三次，2.5μg/ml蛋白酶K，37℃，5-20分鐘（因標本和固定條件而定）處理。磷酸鹽類緩沖液（PBs NaCl 137mmol/l，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄8.1mmol/L，KH₂PO₄1.5mmol/L）洗滌。4％PFA/PBS后固定，PBS洗一次，0.2％甘氨酸/PBS洗二次，每次15分鐘。預雜交：42℃，1小時。預雜交緩沖液：10％硫酸葡聚糖，10％Denhardt液，0.5％吐溫－20，250μg/ml鮭魚精子DNA，500μg/ml酵母tRNA。雜交：42℃，4小時。用2x雜交緩沖液（4xSSC，0.2mol/L磷酸鈉pH6.5，2xDenhardt）溶解已標記探針，使其終濃度為0.1-1.0μg/ml。DNA檢測時把探針覆蓋在標本上，置100℃5分鐘（變性）取出，雜交。mRNA檢測則先把探針置95℃水浴3分鐘，立即置冰水浴，再覆蓋標本上進行雜交。覆蓋標本用液量100-200μl洗滌：2xSSC，50℃過夜。0.2xSSC，室溫1小時。載玻片浸在緩沖液中。顯色（試劑、方法參照斑點雜交的封閉-顯色部分）20分鐘-2小時，顯微鏡下觀察結果。