組織學/一般光學顯微鏡術

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組織學

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應用一般光學顯微鏡（簡稱光鏡）觀察組織切片是組織學研究的最基本方法。取動物或人體的新鮮組織塊，先用固定劑（fixative）固定（fixation），使組織中的蛋白質迅速凝固，防止細胞自溶和組織腐敗。常用的固定劑如酒精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化鋨等，一般常將幾種固定劑配制成混合固定液，以抵消或減弱單種固定劑對組織的收縮或膨脹等缺點，達到更好固定效果。固定后的組織塊（約3～5mm³大小）用石蠟、火棉膠或樹脂等包埋（embedding）成硬塊，以切片機（microtome）切成5～10μm厚的組織切片（tissue section），切片貼在載玻片上經脫蠟等步驟后進行染色。組織塊也可立即投入液氮（－196℃）內快速凍結，用恒冷箱切片機（cryostat）制成冷凍切片（frozen section），這種方法制片迅速，細胞內酶活性保存較好，常用于酶組織化學染色。血細胞和分離培養的細胞可直接涂在玻片上，制成涂片（smear）。疏松結締組織和腸系膜等軟組織可撕成薄片鋪在玻片上（鋪片），牙和骨等堅硬組織可磨成薄片（磨片）。組織切片等標本經染色、透明后，以封固劑和蓋片封固，即可長期保存，鏡下觀察。

堅牢綠（酸性染料）與亞甲藍（堿性染料）的化學結構及其染色反應示意

圖1－1　堅牢綠（酸性染料）與亞甲藍（堿性染料）的化學結構及其染色反應示意

染色（staining）是用染料使組織切片著色，便于鏡下觀察。天然和人工合成的染料甚多,它們都是含發色團的有機化合物，當染料具有助色團成為鹽類物質，即可溶解于水并具電荷，與組織有親合力，使組織著色。含氨基（－NH₂）、二甲氨基〔－N（CH₃）₂〕等堿性助色團的染料，稱堿性染料（basic dye），它的鹽溶液具陽電荷；含羧基（－COOH）、羥基（－OH）或磺基（－SO₃H）等酸性助色團的染料，稱酸性染料（acid dye），它的溶液具陰電荷（圖1－1）。組織的染色原理一般認為基于化學結合或物理吸附作用。細胞和組織的酸性物質或結構與堿性染料親合力強者，稱嗜堿性（basophilia）；而堿性物質或結構與酸性染料親合力強者，稱嗜酸性（acidophilia）；若與兩種染料的親合力均不強者，稱中性(neutrophilia)。組織的基本成分是蛋白質，構成蛋白質的氨基酸常是即有含氨基的，也有含羧基的，是兩性電解質。各種蛋白質的等電點因氨基酸成分的不同而異，其電荷性質又與溶液的pH值相關，根據研究目的選用合適的染色方法，調整好染液的pH值，即可取得良好染色效果。常用的酸性染料如伊紅、堅牢綠、橙黃G等，堿性染料如蘇木精、亞甲藍、堿性品紅等。組織學中最常用的是蘇木精（hematoxylin）和伊紅（eosin）染色法，簡稱HE染色法。蘇木精使細胞核和胞質內的嗜堿性物質著藍紫色，伊紅使細胞質基質和間質內的膠原纖維等著紅色。

物理吸附作用的染色方法，如用蘇丹染料顯示脂肪組織，染料溶于脂肪內，使細胞內的脂滴顯色。又如用硝酸銀、氯化金等重金屬鹽顯示細胞和組織的某些結構，則是使金屬微粒附著在結構表面而呈棕黑色或棕黃色。銀染法中有些組織結構可直接使硝酸銀還原而顯示，稱此為親銀性（argentaffin）；有些結構無直接還原作用，需加入還原劑方能顯色，則稱為嗜銀性（argyrophilia）。還有些組織成分如結締組織和軟骨基質中的糖氨多糖，當用甲苯胺藍（toluidine blue）等堿性染料染色后呈紫紅色，這種現象稱為異染性(metachromasia)，其原理可能是該染料在溶液中呈單體狀態時顯藍色，當它與多陰離子的高分子物質耦合后，染料分子聚合成多聚體而顯紅色（圖1－2）。還有些染色方法的原理至今還不清楚。

異染性示意圖