堿性磷酸酶
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生物化學(xué)特征
堿性磷酸酶名字
alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)
現(xiàn)多用ALP
系統(tǒng)名phosphate-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum)
其他名稱還有alkaline phosphomonoesterase; phosphomonoesterase; glycerophosphatase; alkaline phosphohydrolase; alkaline phenyl phosphatase; orthophosphoric-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum);basic phosphatase
CAS 號: 9001-78-9
堿性磷酸酶
屬于同源二聚體蛋白，分子量為56KDa。每個單體由449個氨基酸組成，完整的AKP分子呈現(xiàn)典型的α/β的拓撲結(jié)構(gòu)，同時每個單體均具有一個活性中心，活性中心區(qū)域由Asp101-Ser102-Ala103三連體、Arg166、水分子、三個金屬離子及其配體氨基酸組成。AKP被phoA 基因編碼，與很多分泌蛋白一樣，在細胞質(zhì)內(nèi)合成氨基末端帶有信號肽的單體前體，信號肽引導(dǎo)前體跨內(nèi)膜運輸后被切除，同源二聚體形成。
堿性磷酸酶是一種能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團的過程被稱為去磷酸化或脫磷酸化。堿性磷酸酶是磷酸酶的一種，磷酸酶的作用與激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，將磷酸基團加到對應(yīng)底物分子上。堿性磷酸酶在堿性環(huán)境有最大活力，對來源于細菌中的ALP來說，其最適pH是8.0，而對來源于牛的ALP則是8.5。
ALP是一種含鋅的糖蛋白，在堿性環(huán)境中（最適Ph為10左右）可以水解各種天然及人工合成的磷酸單酯化合物底物。
人體內(nèi)的來源
人體內(nèi)情況
堿性磷酸酶是廣泛分布于人體各臟器器官中，其中以肝臟為最多其次為腎臟，骨骼、腸、和胎盤等組織,。這種酶能催化核酸分子脫掉5’磷酸基團，從而使DNA或RNA片段的5’-P末端轉(zhuǎn)換成5’-OH末端。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。目前已發(fā)現(xiàn)有 AKP1 、 AKP2 、 AKP3 、 AKP4 、 AKP5 與 AKP6 六種同功酶。其中第 1 、 2 、 6 種均來自肝臟，第 3 種來自骨細胞，第 4 種產(chǎn)生于胎盤及癌細胞，而第 5 種則來自小腸絨毛上皮與成纖維細胞。 血清中的ALP主要來自肝臟和骨骼。生長期兒童血清內(nèi)的大多數(shù)來自成骨細胞和生長中的骨軟骨細胞，少量來自肝。尿中的直接來自于腎小管細胞，并非來源于血液。
堿性磷酸酶主要用于阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查。患這些疾病時，肝細胞過度制造ALP，經(jīng)淋巴道和肝竇進入血液，同時由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高。但由于骨組織中此酶亦很活躍。因此，孕婦、骨折愈合期、骨軟化癥。佝僂病、骨細胞癌、骨質(zhì)疏松、肝膿腫、肝結(jié)核、肝硬變、白血病、甲狀腺機能亢進時，血清堿性磷酸酶亦可升高，應(yīng)加以鑒別。
研究應(yīng)用
堿性磷酸酶也是目前免疫診斷試劑產(chǎn)品最常用的標記酶之一。與辣根過氧化物酶（HRP)相比，ALP用作標記酶的優(yōu)點是，穩(wěn)定性高、靈敏度高，缺點是成本高，標記困難。
在研究中最常用的ALP如下：
◇細菌堿性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase (BAP), 來源：Escherichia coli C4 ；
◇ Shrimp alkaline phosphatase (SAP), 來源：一種北極蝦 (Pandalus borealis) ;
◇ 小牛腸堿性磷酸酶Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP);
◇ 胎盤堿性磷酸酶Placental alkaline phosphatase (PALP)和分泌性堿性磷酸酶the secreted alkaline phosphatase (SEAP)，后者是前者的C末端短缺版——與PALP相比，SEAP沒有PALP的C末端最后24個氨基酸(這24個氨基酸構(gòu)成了與糖基化磷脂酰肌醇靶向錨定的區(qū)域)
ALP主要應(yīng)用于分子生物學(xué)和酶免分析中：
★分子生物學(xué)中主要用作核酸的去磷酸化。因為DNA通常會在5'端結(jié)合磷酸基團，用ALP去磷酸化能防止DNA分子5'端與3'端連接，從而在后續(xù)步驟準備好之前讓DNA分子抑制處于線性化狀態(tài);同樣，通過去磷酸化可用作放射標記示蹤。通常用作這些目的用的最多的是Shrimp alkaline phosphatase (SAP)，因為在反應(yīng)完成之后它是最容易滅活的。
★酶免分析中應(yīng)用最多的是ELISA，以競爭法測小分子抗原為例，抗體先與固相載體結(jié)合，然后讓待測樣品與事先經(jīng)ALP標記過的該抗原競爭地與抗體結(jié)合，洗去未反應(yīng)的過量ALP-抗原，加入顯色底物。則可以通過與按梯度濃度變化的標準品繪出的標準曲線對比從而知道待測樣品中抗原的濃度。ELISA中用的比較多的是 辣根過氧化物酶(HRP)，底物為OPD， 深桔黃色 ，檢測波長492nm；TMB， 藍綠色，檢測波長450nm 堿性磷酸酶，底物為PNPP（對－消基苯磷酸酯）， 黃色 ，檢測波長405nm
★目前工業(yè)上一個普遍的應(yīng)用是作為檢驗牛奶的巴斯的滅菌的標志：被巴斯德過高溫滅菌的分子會被滅活，向其中和未巴斯滅菌的牛奶中加入ALP的底物，2分鐘后未滅菌的樣品應(yīng)該顯黃色，如果待測樣品(指被巴斯滅菌過的牛奶)也能呈現(xiàn)相同顏色，則說明巴斯滅菌溫度未過度。當(dāng)然總有例外，因為有少數(shù)細菌會產(chǎn)生耐熱的ALP。
測定方法
有很多種，我國曾應(yīng)用較廣的為磷酸苯二鈉比色法，但現(xiàn)在應(yīng)用較多的是連續(xù)檢測法。
正常范圍
正常范圍（連續(xù)監(jiān)測法）
女性，1-12歲小于500U/L；大于15歲，40-150U/L；
男性，1-12歲小于500U/L；12-15歲，小于750U/L；大于15歲，40-150U/L。
高值可能說明有單管阻塞現(xiàn)象；低值更多出現(xiàn)于兒童和孕婦身上。高值表明有可能發(fā)生了活性骨沉積(這個可能譯的不準，請指正，原文為active bone deposition)，因為ALP是成骨細胞活動(造骨)的副產(chǎn)物(例如在佩吉氏斯癥［畸形性骨炎］的案例中)。
一般來說，低值要比高值少見。
臨床意義
臨床上測定ALP主要用于骨骼 、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷，尤其是黃疸的鑒別診斷。對于不明原因的高ALP血清水平，可測定同工酶以協(xié)助明確其器官來源。
1．生理性增高：兒童在生理性的骨骼發(fā)育期，堿性磷酸酶活力可比正常人高1～2倍。處于生長期的青少年，以及孕婦和進食脂肪含量高的食物后均可以升高。
2．病理性升高：
(1)骨骼疾病如佝僂病、軟骨病、骨惡性腫瘤、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移等；
(2)肝膽疾病如肝外膽道阻塞、肝癌、肝硬化、毛細膽管性肝炎等；
(3)其他疾病如甲狀旁腺機能亢進。
3．病理性降低：見于重癥慢性腎炎、兒童甲狀腺機能不全、貧血等。
抑制作用
除來源于胎盤外所有哺乳動物的ALP同工酶都能被高精氨酸所抑制；而除來源于腸和胎盤外所有的ALP同工酶都能被左旋咪唑所抑制；而除了來源于胎盤的ALP(PALP和SEAP)外，幾乎所有的ALP都能在65℃2小時即被滅活。
單乙醇胺對堿性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用；
較高濃度的無機磷可競爭性地抑制堿性磷酸酶的活性；
EDTA通過絡(luò)合堿性磷酸酶而導(dǎo)致該酶活性中心微環(huán)境構(gòu)象發(fā)生變化，從而不可逆地抑制堿性磷酸酶的活性；
其他的抑制劑還有聯(lián)苯胺(競爭性)、L-苯丙氨酸和丹酰-L-苯丙氨酸(反競爭性)、含氮雜環(huán)氧釩配合物(選擇性)、五氯酚(對人胎盤堿性磷酸酶反競爭性抑制)等。
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