逆轉(zhuǎn)錄病毒
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逆轉(zhuǎn)錄病毒即RNA病毒，需在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，新合成的cDNA插入宿主的核DNA中，隨宿主DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯達(dá)到擴(kuò)增目的的一類病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個結(jié)構(gòu)蛋白基因：gag-編碼病毒衣殼、基質(zhì)等結(jié)構(gòu)蛋白的基因；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(p66/p51)、
蛋白水解酶和整合酶；env-編碼gpl20和gp41兩種包膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因（vonc），即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來，已設(shè)計構(gòu)建成一些缺陷型病毒（defective virus）使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信號（一段尚未鑒定的DNA順序）。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細(xì)胞株，這種細(xì)胞株包含有輔助病毒（helper virus）。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號，因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA，進(jìn)入骨髓細(xì)胞，病毒DNA插入宿主細(xì)胞基因組，基因的活性得到表達(dá)。這時，由于骨髓細(xì)胞里面沒有輔助病毒，所以整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過細(xì)胞分裂而傳給下一代子細(xì)胞。
1970年科學(xué)家在致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)一種特殊的RNA病毒聚合酶，該酶能以RNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，合成cDNA。這一過程與一般病毒轉(zhuǎn)錄方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄，催化此過程的酶稱為逆轉(zhuǎn)錄酶,后來發(fā)現(xiàn)在哺乳動物的胚胎細(xì)胞和正分裂的淋巴細(xì)胞也含有。
逆轉(zhuǎn)錄病毒又稱為攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒，它先侵入宿主細(xì)胞以病毒RNA為模板，靠酶形成DNA環(huán)化，然后合到宿主細(xì)胞的染色體中去以原病毒形式在宿主細(xì)胞中一代代傳下去。
目錄 |
逆轉(zhuǎn)錄病毒分類
逆轉(zhuǎn)錄
按照目前國際病毒分類標(biāo)準(zhǔn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒科分為7個屬：
α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Alpharetrovirus
β逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Betaretrovirus
γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬 Gammaretrovirus
δ反轉(zhuǎn)錄病毒屬 Deltaretrovirus
ε反轉(zhuǎn)錄病毒屬 Epsilonretrovirus
慢病毒屬 Lentivirus
泡沫病毒屬 Spumavirus
其中的慢病毒屬又分為5個組，包括牛慢病毒組、馬慢病毒組、貓慢病毒組、羊慢病毒組和人類慢病毒組。HIV在病毒“大家族”中的定位是逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類免疫缺陷病毒組。
逆轉(zhuǎn)錄病毒和基因治療
從1990年國施行第一例基因治療計劃到目前為止，全世界共有幾百例臨床計劃在實(shí)施中。當(dāng)初人們對基因治療普遍寄予厚望，但結(jié)果卻往往不盡如人意。人們意識到在基因組、基因的表達(dá)調(diào)控及疾病發(fā)生的機(jī)理沒有徹底闡明之前，基因治療還很難取得突破性進(jìn)展。但基因治療的出現(xiàn)，畢竟給我們治療一些用傳統(tǒng)療法難以治愈的疾病帶來了新的希望。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
逆轉(zhuǎn)錄病毒的許多特點(diǎn)使其成為基因轉(zhuǎn)移載體的上佳選擇。最重要的一點(diǎn)是它可以有效的整合入靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶的外源基因。病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，其基因組不會發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基因也不會改變。而另一類整合載體——腺相關(guān)病毒，以同源重組的方式整合，整合過程中病毒基因組發(fā)生重排，可能會影響到外源基因的結(jié)構(gòu)與功能
如果能實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)移，基因治療在對付遺傳性疾病、減緩腫瘤發(fā)展、戰(zhàn)勝病毒性感染和終止神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等方面都會有廣闊的應(yīng)用前景。這就要求在載體改造、載體的靶向性、外源基因的表達(dá)調(diào)控等諸多方面取得顯著進(jìn)展。基因轉(zhuǎn)移載體可分兩大類：病毒性載體和非病毒性載體。非病毒性載體的方法包括裸DNA注射、基因槍法、多聚賴氨酸或陽離子脂質(zhì)體包裹DNA法等。一般非病毒性載體毒性成分少，且較安全。但它們存在共同的弱點(diǎn)：效率低且攜帶基因表達(dá)時間短。所以目前研究仍是一些病毒性載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)用最早，研究也相當(dāng)成熟，目前仍被廣泛應(yīng)用。慢病毒也是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒，它表現(xiàn)出的一些特點(diǎn)使人們對其逐漸產(chǎn)生了興趣。逆轉(zhuǎn)錄病毒的許多特點(diǎn)使其成為基因轉(zhuǎn)移載體的上佳選擇。最重要的一點(diǎn)是它可以有效的整合入靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所帶的外源基因。病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，其基因組不會發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基因也不會改變。而另一類整合載體——腺相關(guān)病毒，以同源重組的方式整合，整合過程中病毒基因組發(fā)生重排，可能會影響到外源基因的結(jié)構(gòu)與功能。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶向性
逆轉(zhuǎn)錄病毒可以與多種細(xì)胞表面蛋白結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞，其宿主細(xì)胞范圍很廣。逆轉(zhuǎn)錄病毒的親嗜性存在物種之間的差異，據(jù)此可將其分為三類：(1)單嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒(ectropic retrovirus)，只感染小鼠和少數(shù)幾個品種的大鼠；(2)兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒(amphotropic retrovius)，能感染小鼠的細(xì)胞，也能感染其他種屬動物的細(xì)胞；(3)異嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒(xenotropic retrovirus)，能感染多種動物細(xì)胞，但不能感染小鼠細(xì)胞。目前使用較多的是兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒，即以兼嗜性包裝細(xì)胞包裝病毒顆粒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍由病毒顆粒表面的包被蛋白(Env)決定，病毒基因組不影響其靶向性，不同的基因組可用相同的Env包被，且Env來自何種病毒，包裝出的病毒顆粒就叫該病毒的假病毒。
通過改變Env蛋白可以改變載體的靶向性。如用水泡性口炎病毒的G蛋白包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組產(chǎn)生假病毒(pseudotype)，可拓展逆轉(zhuǎn)錄病毒的靶細(xì)胞范圍并賦予病毒顆粒新的特性。兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒一般結(jié)合細(xì)胞表面的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體而進(jìn)入細(xì)胞，但有一些重要的靶細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、早期造血干細(xì)胞磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平很低，而導(dǎo)致載體對其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下。G蛋白包裝的假病毒則得有效感染這些細(xì)胞。這種假病毒還可以用超速離心進(jìn)行濃縮達(dá)到很高的滴度(109 cfu/ml)，普通的逆轉(zhuǎn)錄病毒只能達(dá)到106 cfu/ml；G蛋白還能抵抗人類補(bǔ)體的滅活作用，使其適于作體內(nèi)(in vivo)的基因轉(zhuǎn)移。
為提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細(xì)胞的特異性，還可以在原來的病毒Env蛋白上接上一段具有特異靶向的多肽，目前應(yīng)用較多的是單鏈可變區(qū)抗體(scFv)。如Martin等設(shè)計的特異靶向黑色素瘤細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒。他們在病毒包被糖蛋白的表面結(jié)構(gòu)域(SU)上依次接上間質(zhì)金屬蛋白酶的酶切位點(diǎn)、一段富含脯氨酸的肽段及一段特異識別高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)的SCFU。90%的人黑色素瘤細(xì)胞高水平表達(dá)HMW-MAA這一穿膜分子，而絕大多數(shù)成人組織不表達(dá)。富含脯氨酸的肽段則暫時阻端SU和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)合。腫瘤細(xì)胞表面還有高表達(dá)的間質(zhì)金屬蛋白酶，它在腫瘤細(xì)胞對正常組織的侵入中發(fā)揮重要作用。這樣改造過的載體在SCFV的導(dǎo)向下達(dá)到腫瘤部位，腫瘤細(xì)胞表面的金屬蛋白酸切去SU上的SCFV和脯氨酸肽段，SU和腫瘤細(xì)胞表面的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，從而大大提高了載體靶向的特異性。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染非分裂細(xì)胞的探索
具有感染終末分化細(xì)胞的能力，高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和持續(xù)且可控制的基因表達(dá)是理想的基因治療載體的三大特點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒雖具有后面兩個優(yōu)點(diǎn)，但不能感染非分裂細(xì)胞如肌肉、大腦、肺及肝組織中的這些可以做為基因治療靶細(xì)胞的重要細(xì)胞。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制特點(diǎn)，它感染細(xì)胞時，細(xì)胞分裂需處于DNA合成階段。因此有人嘗試使用組織損傷或部分切除來誘導(dǎo)靶細(xì)胞分裂。例如肝臟部分切除可以極大地提高逆轉(zhuǎn)錄病毒在肝內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
還有一種途徑是利用一些基因的產(chǎn)物來誘導(dǎo)間歇期細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制來增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染。SV40的大T抗原可以誘導(dǎo)終末分化的肌肉細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。表達(dá)溫度敏感的大T抗原的肝細(xì)胞可被逆轉(zhuǎn)錄病毒高效感染。用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)預(yù)先刺激間歇期細(xì)胞也可以大大增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染效率。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)的調(diào)控
有人用ex vivo的方法，在肌細(xì)胞中表達(dá)IX因子，治療小鼠血友病B。發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞回輸小鼠后5～7d，IX因子的表達(dá)即被“關(guān)閉”了。證明不是由于細(xì)胞丟失、基因刪除或免疫機(jī)制的原因。而可能是由于持續(xù)表達(dá)的外源基因誘導(dǎo)機(jī)體對其進(jìn)行修飾而失去表達(dá)，因此要求基因在誘導(dǎo)物的作用下短暫表達(dá)，目前使用較多的有四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)和雌激素誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)等。除此之外增強(qiáng)與啟動子的正確組合也能避免基因表達(dá)被關(guān)閉。仍以上例，若用ATP肌酸磷酸轉(zhuǎn)移酶的增強(qiáng)子——啟動子來控制外源基因表達(dá)，只能得到低水平的表達(dá)，換用ATP肌酸磷酸轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)子——巨細(xì)胞病毒啟動子的嵌合載體，外源基因的表達(dá)可以持續(xù)兩年。尋找載體調(diào)控元件的合理組合需長期摸索，在多基因載體中這種任務(wù)顯得更加艱巨。
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